التحكم في الالتصاق الخلية باستخدام تقنيات النقش هيدروجيل للتطبيقات في المجهر قوة الجر
يناير 29, 2022
يتم الجمع بين الطباعة الحجرية القريبة من الأشعة فوق البنفسجية والمجهر قوة الجر لقياس القوى الخلوية على الهيدروجيلات micropatterned. يتيح الإطلاق الموجه للخلايا المفردة الناجم عن الضوء عددا كبيرا من القياسات على نفس العينة.
الهدف العام لهذا الإجراء هو تصنيع الهيدروجيلات الدقيقة النقش لدراسات المجهر قوة الجر 2D. ويتم ذلك أولا عن طريق جعل زلة غطاء زجاجي ميثاكريلاتيد وتشكيل الطبقة الأولى من هيدروجيل البولي أكريلاميد على ذلك. الخطوة الثانية هي إنشاء طبقة هيدروجيل أخرى تحتوي على حبات فلورية للفحص المجهري لقوة الجر.
يقع الهيدروجيل مع زلة غطاء نمط صغير فوقه ، مما يؤدي إلى نقل بروتينات مصفوفة النمط الدقيق على سطح الهيدروجيل. بعد ذلك ، يتم ترك هيدروجيل البولي أكريلاميد للبوليمرات في درجة حرارة الغرفة لمدة 45 دقيقة. ثم تتم إزالة زلة الغطاء العلوي بعناية.
يستخدم التصوير المجهري الفلوري لإظهار وجود الخرز والنقل الناجح لبروتينات المصفوفة خارج الخلية المنقوشة الدقيقة. تساعد هذه الطريقة على قياس العديد من قوى الجر بكفاءة ودقة باستخدام الضوء واستخدام إطلاق الخلايا. مما يجعل من الممكن الحصول على عدد أكبر من المراقبة التجريبية من نفس العينة.
لذا إثبات الإجراء سيكون جويل كريستيان، طالب دراسات عليا من مختبري. أضف 10 ملليلترات من الماء المقطر المزدوج إلى كوب. بعد, إضافة 18.75 ملليلتر من حمض الخليك, 18.75 ملليلتر من 3-بروبيل ميثاكريلات و 252.5 ملليلتر من الإيثانول إلى الحل.
عندما يكتمل الحل، قم بنقله إلى طبق بلوري. خذ 24 ملليمترا من قسائم الغطاء المستدير، وانظفها بمسح دقيق، ووضعها في رف تفلون مخصص. ثم تزج في الحل واحتضان لمدة 15 دقيقة.
خذ الحامل وشطفه بالإيثانول. جفف الغطاء ينزلق تحت تدفق الهواء. يمكن تخزين قسائم الغطاء الميثاكريلاتية لمدة تصل إلى شهر واحد في درجة حرارة الغرفة.
خذ زلة غطاء دائرية عيار 15 ملليمتر ووضعها على طبق بيتري. استخدم قلم ألماس لوضع علامة على الجانب العلوي من قسيمة الغطاء. ثم انتقل إلى التنظيف عن طريق علاج بلازما الأكسجين.
زلة الغطاء نظيفة في 0.4 ملليبار و 200 واط لمدة دقيقتين. ماصة 100 ميكرولتر من 0.01٪ من محلول بولي-إل-ليسين على سطح الغطاء زلة واحتضان لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. بعد ذلك، اغسل الغطاء ب 10 ملليمولار عند رقم PH 8.5.
إخراج السائل الزائد، ولكن الحفاظ على السطح الرطب. ماصة 100 ميكرولتر من 50 ملليغرام لكل ملليلتر من mPEG-SVA في 10 ملليمولار درجة الحموضة 8.5 الحل على سطح زلة الغطاء واحتضان لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة. بعد ذلك، شطف الغطاء زلات مع 10 ملليمولار الحموضة 8.5.
ثم أضف اثنين من ميكرولتر من هلام PLPP تليها 40 ميكرولتر من الإيثانول على السطح. إمالة بلطف طبق بيتري لتجانس الحل. انتظر لمدة خمس دقائق للحل للاستقطاب.
ضع الغطاء ينزلق داخل حفرة أسفل 35 ملليمتر طبق بيتري. وضع طبق بيتري التي تحتوي على زلة الغطاء على خشبة المسرح المجهر. ضبط التركيز على سطح الزجاج.
تحميل وقفل نمط مرسومة مسبقا. بدء النقش بجرعة الأشعة فوق البنفسجية من 30 ملليجول لكل ملليمتر مربع. بعد الانتهاء من خطوة النقش، أخرج زلة غطاء النمط وشطف السطح مع برنامج تلفزيوني.
احتضان العينة مع خليط 100 ميكرولتر من 25 ميكروغرام لكل فيبروكتين ملليلتر و 25 ميكروغرام لكل ملليلتر الفيبرينوجين المترافق مع اليكسا 488 حل في برنامج تلفزيوني لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة. لإعداد ركيزة الهيدروجيل، ابدأ بوضع الغطاء الميثاكريلاتي في طبق بيتري. للبدء، قم بإعداد محلول AgA المؤأكسد الطازج بإضافة 9.55 ملليلتر من الماء المقطر المزدوج إلى أنبوب فالكون 15 ملليلتر.
ثم أضف 0.5 ملليلتر من AgA. ثم أضف 42 ملليغرام من الصوديوم ميتا بيروفاتي إلى الحل. وضع الحل على شاكر لمدة أربع ساعات.
ثم إعداد محلول المخزون عن طريق خلط الأكريلاميد، بيس أكريلاميد، والمياه المقطرة مزدوجة وفقا للجدول 1. يمكن الاحتفاظ بحل المخزون لمدة تصل إلى عام عند أربع درجات مئوية. إعداد حل العمل للطبقة السفلية عن طريق خلط 99.3 ميكرولتر من محلول المخزون مع 0.5 ميكرولتر من كبريتات الأمونيوم 1٪ و 0.2 ميكرولتر من TEMED.
خذ 10 ميكرولتر من الحل وماصة قطرة الحكمة على زلة غطاء الميثاكريلاتي. ضع بعناية زلة غطاء دائري من عيار 15 ملليمترا على القطرة وانتظر 45 دقيقة حتى يبوليمر. بعد ذلك، افصل زلة الغطاء العلوي بالمشرط.
ثم إعداد حل العمل للطبقة العليا عن طريق خلط 93.3 ميكرولتر من محلول المخزون مع واحد MICROLITER مؤأكسدة HEA، خمسة حبات الفلورسنت ميكرولتر، 0.5 ميكرولتر من كبريتات الأمونيوم 1٪ و 0.2 ميكرولتر من TEMED. اتخاذ خمسة ميكرولتر من الحل وماصة انها قطرة الحكمة على هيدروجيل الطبقة السفلى. ضع بعناية زلة غطاء نمط صغير على القطيرات.
انتظر 45 دقيقة حتى يبوليمر. فصل بلطف زلة الغطاء مع مشرط. والغراء الغطاء زلة على الجزء السفلي من لوحة مخصصة حفر ستة آبار.
إضافة برنامج تلفزيوني إلى الآبار. لرؤية الخلايا، يستنشق برنامج تلفزيوني من لوحة من ستة آبار. بالنسبة للخلايا الليفية، أضف نسبة عالية من الجلوكوز DMEM تحتوي على L-glutamine وتكملها ب 10٪ FPS و1٪ بنسلين وستريبتومايسين.
احتضان الخلايا بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية و 5٪ CO2. تشغيل ثاني أكسيد الكربون والتدفئة لمرحلة المجهر. ثم قم بتشغيل المجهر ووضع لوحة البئر على المسرح.
إعداد نمط الإضاءة ووضع علامة على الخلايا ذات الاهتمام. إعادة التركيز على سطح الهيدروجيل. الحصول على صورة الخلايا في قناة برايتفيلد.
لالتقاط صورة الخرز في الحالة المشوهة، انتقل إلى القناة. ثم التبديل إلى قناة الليزر وإلقاء الضوء على الخلية وفقا لنمط لمدة ثلاث دقائق. وهذا يتوافق مع جرعة من 6000 ملليجول لكل ملليمتر مربع.
بعد ذلك، قم بتبديل القناة والحصول على صورة الخرز في الحالة غير المتشكلة. لحساب قوى الجر، افتح صور حبة الفلورسنت التي تم تصحيحها بالفعل للانجراف الجانبي. يتم تفصيل التحليل الكامل لقوى الجر في النص المرفق.
وللتحقق من التصاق الخلايا الانتقائي بالمناطق المنقوشة على سطح الهيدروجيلات، صورت العينات بالمنظار المجهري الفلوري باستخدام بروتينات مصفوفة تحمل علامات مسبقة وبمنظار دقيق من برايتفيلد لتصور الخلايا. وتباينت الخصائص الميكانيكية للهيدروجيلات البولي أكريلاميد عن طريق خلط كميات مختلفة من الأكريلاميد والبيس أكريلاميد. تم تقييم صلابة الهيدروجيل مع تجارب المسافات البادئة النانوية عن طريق المجهر القوة الذرية.
وأجريت قياسات قوة الجر بعد تطبيق المكانية، التي تسيطر عليها زمنيا، والإضاءة شعاع الليزر فوق البنفسجي لإلقاء الضوء بشكل انتقائي مناطق بحجم ميكرون من هيدروجيل البولي أكريلاميد. وأعيد بناء قوى الجر باستخدام نظامية FTTC مع معلمة تنظيم اختارها التحقق من صحة الصليب المعمم. نهجنا وحدات نموذج على أساس المجهر قوة الجذب جنبا إلى جنب مع الضوء واستخدام الإفراج عن الخلايا الصغيرة نمط متعدد الاستخدامات ويمكن أن تستخدم أكثر مع المجهر الأخرى وإعداد التصوير لتحسين دقتها وحساسيتها.
نظرة عامة
تجمع هذه الدراسة بين الطباعة الضوئية القريبة من الأشعة فوق البنفسجية ومجهر قوة الجر لقياس القوى الخلوية على هيدروجيلات مجهرية. تسمح الطريقة بالإطلاق الموجه للخلايا عن طريق الضوء، مما يسهل إجراء عدد كبير من القياسات من نفس العينة.
مكونات الدراسة الرئيسية
مجال العلوم
- علم الأعصاب
- بيولوجيا الخلية
- الفيزياء الحيوية
الخلفية
- مجهر قوة الجر ضروري لدراسة الميكانيكا الخلوية.
- توفر الهايدروجيلات المجهرية بيئة مضبوطة للتصاق الخلايا.
- الطباعة الضوئية القريبة من الأشعة فوق البنفسجية تمكن من نمذجة دقيقة لبروتينات المصفوفة خارج الخلية.
- يمكن أن يعزز القياس الفعال للقوى الخلوية فهمنا لسلوك الخلية.
غرض الدراسة
- لتصنيع هيدروجيلات مجهرية لمجهر قوة الجر.
- لتحسين دقة وكفاءة قياس القوى الخلوية.
- لإظهار الإجراء لقياس قوى الجر الخلوية باستخدام طالب دراسات عليا كمُظهِر.
الطرق المستخدمة
- إعداد شرائح زجاجية مغلفة بالميثاكريليت.
- تشكيل طبقات هيدروجيل البولي أكريلاميد مع كرات فلورية.
- استخدام الميكروسكوب الفلوري للتحقق من نقل النمط الناجح.
- تطبيق الطباعة الضوئية القريبة من الأشعة فوق البنفسجية لنمذجة دقيقة.
النتائج الرئيسية
- تصنيع ناجح لهايدروجيلات مجهرية.
- قدرة مثبتة على قياس قوى الجر الخلوية بفعالية.
- عدد كبير من القياسات تم الحصول عليها من عينة واحدة.
- التحقق من وجود الكرات ونقل النمط من خلال التصوير.
الاستنتاجات
- تعزز الطريقة المدمجة دراسة الميكانيكا الخلوية.
- يسمح الإطلاق الموجه للخلايا عن طريق الضوء بالقياس المتكرر.
- يمكن تطبيق هذا النهج على أنواع مختلفة من الخلايا لإجراء المزيد من البحوث.
الأسئلة الشائعة
Executive Industry Relevance
Standardizing cell adhesion patterns enables reproducible traction force measurements, addressing variability in cell shape and force output that limits throughput in mechanobiology assays. This approach supports predictive confidence in target validation by providing quantitative, deformation-based readouts of cellular mechanotransduction pathways. The method enhances assay reliability for early discovery workflows where mechanical phenotype correlates with drug response or target engagement.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by controlling adhesion geometry to isolate force-dependent signaling pathways.
- Operational Value: Reduces biological noise from heterogeneous cell spreading, improving assay consistency across replicates.
- Predictive Value: Supports mechanistic de-risking of targets involved in mechanosensing, such as YAP/TAZ or integrin-linked kinases.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates standardized, quantifiable traction force matrices for comparing compound effects on cellular contractility.
- Operational Value: Allows sequential force measurements from the same sample via localized UV release, increasing data density per well.
- Assay Readiness: Produces reusable hydrogel substrates with defined adhesive islands compatible with high-resolution imaging and bead-based displacement tracking.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Links in vitro mechanical phenotypes to disease-relevant models where altered traction forces indicate pathological states.
- Preclinical Utility: Enables dose-response profiling of compounds targeting cytoskeletal regulators or focal adhesion components.
- Risk-Adjusted Advancement: Identifies mechanotoxic liabilities early by detecting aberrant force generation in patterned cellular systems.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from target hypothesis testing to lead optimization, particularly for pathways where mechanical signaling modulates target validity or compound efficacy.
- Discovery Biology: Supports pathway clarification by enabling controlled application and release of mechanical cues to dissect force-dependent signaling nodes.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative displacement readouts of embedded beads as a proxy for cellular traction forces across conditions.
- Analytics: Employs regularized Fourier Transform Traction Cytometry (FTTC) to reconstruct traction fields, providing standardized force maps for comparative analysis.
- Translational Research: Connects mechanical output to phenotypic outcomes only when supported by disease models showing traction force alterations in fibrosis, cancer, or stem cell differentiation.
- Enterprise Reuse: Positions the hydrogel patterning workflow as a modular, adaptable platform for mechanophenotyping across multiple projects and cell types.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation by reducing confounding variables in cellular force measurements.
- Operational Value: Enhances reproducibility and throughput through standardized adhesion patterns and sequential sampling via light-induced release.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by enabling early detection of mechanobiological liabilities that may lead to late-stage attrition.
- Portfolio Impact: Facilitates risk-adjusted prioritization of targets based on mechanical phenotype concordance with disease models.
Implementation Considerations
- Requires expertise in photolithography, hydrogel chemistry, and fluorescence microscopy for pattern fabrication and bead tracking.
- Depends on UV illumination systems with spatial control and polyacrylamide synthesis capabilities for tunable elasticity.
- Necessitates standardization of protein coating protocols and UV dosing to ensure consistent adhesion patterns across batches.
- Involves adaptation considerations when extending to 3D models or primary cells with distinct adhesion kinetics.
- Practical limitations include UV-induced hydrogel degradation over repeated cycles and bead photobleaching during prolonged imaging.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:04
Introduction
1:22
Preparation of Methacrylated Coverslips
2:39
Micropatterning of Extracellular Matrix Proteins on Glass Coverslips
5:31
Fabrication of Patterned Polyacrylamide Hydrogels
9:15
Local Release of Cell Traction Forces by UV-A Laser Illumination
10:26
Image Processing, Particle Image Velocity and Calculation of Traction Forces
10:55
Results
11:56
Conclusion
