عزل خلايا العضلات الملساء الأبهرية الأولية الخاصة بالمريض وقياسات الانقباض شبه الكمية في الوقت الفعلي في المختبر

تسمح هذه الطريقة للباحثين بدراسة تقلص الخلايا لخط خلايا مريض متعدد في وقت واحد. يسمح لنا بدراسة الأمراض بشكل أسرع وأكثر كفاءة. تسمح لنا هذه التقنية بقياس تقلص الخلايا في الوقت الفعلي.

في غضون ساعة ، يمكننا الحصول على قيم الانكماش لعشرات الخلايا. أثبتنا لأول مرة أن تقلص الخلايا العضلية ينخفض في مجموعة من المرضى الذين يعانون من تمدد الأوعية الدموية الأبهري. يمكن أن يكون هذا مؤشرا حيويا جديدا أو هدفا للعلاج الطبي.

ابدأ بتعقيم زوجين من الملقط الجراحي والمشرط عن طريق غمرهما في 70٪ من الإيثانول ثم مسحهما جافين. ثم ماصة اثنين من ملليلتر من SMC المتوسطة في طبق بتري حيث سيتم إجراء تشريح الأنسجة. ماصة التالية 2.5 ملليلتر من SMC المتوسطة في قارورتين T-25.

قم بتدوير القوارير بحيث يغطي الحجم الصغير من الوسط السطح بأكمله. فحص الخزعة بصريا ، وتحديد الطبقات الأبهرية الثلاث من خلال وجود لويحات تصلب الشرايين على الجانب الداخلي والنسيج الضام الغروي على الجانب العرضي لتمييز الطبقات. لعزل SMCs عن الوسائط ، قم بإزالة الطبقتين الأخريين عن طريق وضع الأنسجة ذات لوحة intima الجانبية لأعلى أولا ، ثم قم بإزالة اللوحة الصلبة عن طريق سحبها بعيدا عن الأنسجة باستخدام ملقط أثناء دفع الأنسجة لأسفل باستخدام الزوج الثاني من الملقط حتى تكون الطبقة الإنسية الموحدة الوردية مرئية.

الآن اقلب الأنسجة وكرر نفس الإجراء عن طريق سحب الطبقة المغامرة ، مع التأكد من إزالة جميع الأجزاء المرئية في أكبر عدد ممكن من المحاولات حسب الحاجة لأن هذه الطبقة لن تنفصل عن الوسائط بسهولة. بمجرد عزل طبقة الوسائط ، قم بقطع الأنسجة إلى مكعبات عن طريق الضغط على الوسائط لأسفل باستخدام الملقط وقطع الأنسجة في اتجاه واحد باستخدام المشرط مما يؤدي إلى إجراء تخفيضات نظيفة أحادية الاتجاه لتقليل الضرر. ضع 10 إلى 20 من قطع الأنسجة هذه في الربع العلوي من قشور T-25 باستخدام الملقط.

بعد تعقيم زوجين من الملقط الجراحي والمشرط كما هو موضح سابقا ، ماصة ملليلتر من وسط الخلايا الليفية في طبق بتري حيث سيتم إجراء تشريح الأنسجة. ثم ماصة 2.5 ملليلتر من وسط الخلايا الليفية في قارورتين T-25 وتدور القوارير حولها بحيث يغطي الحجم الصغير للوسط السطح بأكمله. افحص الخزعة بصريا لتحديد البشرة ذات سطح الجلد الذي يمكن التعرف عليه ، وأحيانا بشعر مرئي ، ثم ابحث عن الدهون الصفراء واللزجة تحت الجلد على الجانب الآخر.

الطبقة بين البشرة والدهون تحت الجلد هي الأدمة ، مصدر الخلايا الليفية القابلة للحياة. لعزل الخلايا الليفية عن الأدمة، قم بإزالة الطبقتين الأخريين عن طريق وضع الأنسجة على جانب الأدمة لجعل جميع الطبقات الثلاث مرئية. ثم امسك الأنسجة لأسفل باستخدام الملقط واقطع البشرة بأكملها في خط نظيف واحد دون الإضرار بالأنسجة.

الآن اقلب الأنسجة وكرر نفس الإجراء عن طريق القطع داخل الأدمة بالتوازي مع الحدود مع الدهون تحت الجلد. بمجرد عزل الأدمة ، قم بقطع الأنسجة إلى مكعبات تضغط على الأنسجة لأسفل باستخدام ملقط وتقطع الأنسجة في اتجاه واحد باستخدام المشرط. ثم ضع 10 إلى 20 من قطع الأنسجة هذه في الربع العلوي من قارورة T-25 باستخدام الملقط.

عد الخلايا باستخدام عداد خلية آلي وزرع SMCs في ثلاثة أضعاف بكثافة بذر تبلغ 30،000 خلية لكل بئر في 200 ميكرولتر من وسط SMC في لوحة ECIS المغلفة بالجيلاتين. ضع اللوحة مع SMCs في حامل ECIS المكون من 96 بئرا في حاضنة زراعة الخلايا. انقر نقرا مزدوجا فوق برنامج ECIS Applied BioPhysics لفتح البرنامج واضغط على زر الإعداد.

تحقق مما إذا كانت جميع الأقطاب الكهربائية على اتصال بالحامل في اللوحة السفلية اليسرى المسماة "تكوين جيد". إذا لم تكن الأقطاب الكهربائية متصلة بشكل صحيح ، فاضبط اللوحة في الحامل قبل بدء القياس. الآن حدد نوع اللوحة في نفس اللوحة بالنقر فوق نوع الصفيف.

بعد ذلك ، قم بإعداد ماصتين محددتين بحجم ميكرولتر و 150 ميكرولتر. قبل البدء في التحفيز ، اضغط على Mark في البرنامج ووضع تعليق. لتحفيز الخلايا ، قم بإزالة الغطاء ووضعه على سطح معقم داخل الحاضنة.

ثم حث انكماش SMC عن طريق سحب ميكرولترين من محلول عمل الأيونومايسين في كل بئر في أسرع وقت ممكن. بمجرد تحفيز جميع الخلايا ، اخلط الوسط في الآبار باستخدام الماصة الثانية. لتحديد قابلية تكرار القياس بين التجارب، تم رسم قياسين مستقلين لجميع خطوط خلايا التحكم والمريض المضمنة كمخطط Bland-Altman، مما يدل على أن هذه الطريقة لم تظهر التباين خارج فترة الثقة، باستثناء خط خلية شاذ واحد.

أظهر بئران تم زرعهما بنفس التجربة وتم تحفيزهما في وقت واحد نفس منحنى الاستجابة التعاقدية عمليا. للتحقق مما إذا كانت الاستجابة المعروضة هي انكماش وليس إجهادا تناضحيا بسبب تحفيز الأيونومايسين ، تم استبدال الوسط بعد التحفيز وتم تسجيل سلوك الخلايا ، مما أظهر أن الخلايا المحفزة بدأت تنتشر فوق القطب مرة أخرى. أظهرت الاستجابة الانقباضية في SMCs المستمدة من الأبهر السليم غير الموسع استجابة متوسطة بنسبة 61٪ مقارنة بمتوسط الاستجابة بنسبة 52٪ من مرضى تمدد الأوعية الدموية الأبهري البطني.

تم استخدام متوسط الاستجابة الانقباضية للمجموعة الضابطة لتحديد أربعة مرضى لديهم قيم انكماش أقل من القيم العادية. أكد تحليل اللطخة الغربية والقياس الكمي اللاحق أن الخلايا تعبر عن علامات SMC. لتحديد القدرة التكاثرية ل SMC ، تم إجراء qPCR ل Ki67.

كان تعبير Ki67 قابلا للاكتشاف في جميع الخلايا ، لكنه لم يرتبط بالإخراج المقلص. عند تحفيز الخلايا للانكماش ، تذكر عدم سحب الكثير من الآبار في نفس الوقت وحاول ماصة في أسرع وقت ممكن. قد يحتاج هذا الإجراء إلى بعض الممارسة.

باستخدام هذه الطريقة ، قمنا بتقسيم المرضى بناء على انكماشهم وتقليل التعاقد الطبيعي مما سمح لنا بالتحقيق في هؤلاء المرضى والروابط بخصائصهم السريرية مثل التدخين.