القياس الكمي للمعلمات الوعائية في شبكية العين الكاملة للفئران ذات اعتلال الشبكية غير التكاثري والتكاثري

في اعتلال الشبكية ، تكون التغيرات الوعائية هي أول علامة يتم اكتشافها من قبل الأطباء. يتابعون تطور المرض ، ويختارون العلاج وفقا لهذه التغييرات. تم تطوير العديد من النماذج الحيوانية من أجل دراسة مراحل مختلفة من علم الأمراض.

في هذا العمل ، سنوضح كيفية قياس التغيرات الوعائية المختلفة. لذلك ، سنستخدم نموذجين حيوانيين. واحد من هذه هو نموذج فأر اعتلال الشبكية الناجم عن الأكسجين ، والذي يعيد إنتاج اعتلال الشبكية الخداجي وبعض جوانب اعتلال الشبكية السكري التكاثري.

هنا ، سنقوم بقياس المناطق اللاوعائية ، والمناطق الوعائية الجديدة ، وتوسع الشرايين وتعرجها. في مختبرنا ، تم تطوير نموذج فأر متلازمة التمثيل الغذائي ، والذي يحفز اعتلال الشبكية غير التكاثري. تم تقييم كثافة الأوعية الدموية والتفرع في هذا العمل.

عند تضحية الفئران ، قم بالاستئصال بالمقص. إصلاح العيون المحصنة مع paraformaldehyde الطازجة لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة. تحت المجهر التشريحي ، قم بإزالة القرنيات بالمقص عن طريق قطع على طول الحافة وتشريح الشبكية بأكملها.

تخلص من الجزء الأمامي من العين، ثم افصل الشبكية عن RPE-choroid. ضع الشبكية في 200 أنبوب ميكرولتر. ثم قم بحظر الشبكية واختراقها في 100 ميكرولتر من TBS تحتوي على 5٪ من ألبومين مصل البقر Triton خلال ست ساعات عند أربع درجات مع إثارة لطيفة في الخلاط.

ثم عكس الأنبوب لوضع شبكية العين في الكوب وإزالة محلول الحجب بالماصة. أضف محلول 100 ميكرولتر يحتوي على إيزوليكتين. لف الأنابيب بورق الألومنيوم لحماية العينات من الضوء.

احتضن الشبكية بمحلول اللكتين بين عشية وضحاها عند أربع درجات مع إثارة لطيفة في الخلاط. اغسل شبكية العين ب 100 ميكرولتر من TBS-Triton لمدة 20 دقيقة مع إثارة لطيفة في الخلاط. كرر هذه الخطوة ثلاث مرات.

ضع شبكية العين في شريحة وأضف قطرة من PBS. تحت المجهر التشريحي ، قم بإجراء أربعة جروح بعيدة بالتساوي من حواف الشبكية نحو العصب البصري. لكشف بتلات الشبكية، استخدم ملقط أو قطع صغيرة من ورق الترشيح.

تأكد من أن جانب المستقبلات الضوئية متجه لأسفل. قم بإزالة PBS المتبقي من الشريحة باستخدام ورق التصفية. ثم أضف وسيط التثبيت وغطاء.

اتركه يجف لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة. تخزين الشرائح على أربع درجات محمية من الضوء. عند المجهر البؤري ، ضع الشريحة في اللوحة وجها لأسفل.

ركز الضفيرة الفائقة للأوعية الدموية في الشبكية وحدد منطقة لبدء الحصول على الصورة. تعيين معلمات الليزر العامة في البرنامج. اضبط الإحداثيات في المحاور X وY وZ.

تهيئة المسح الضوئي. بمجرد انتهاء عملية المسح الضوئي ، افتح الصورة واحفظها بامتداد مفضل. في برنامج ImageJ FIJI، انتقل إلى شريط القوائم وانقر فوق ملف، فتح.

حدد الصورة المراد معالجتها. في نافذة خيار استيراد التنسيقات الحيوية، حدد عرض بيانات تعريف OME-XML وانقر OK.In نافذة بيانات تعريف OME، وابحث عن معلومات حجم البكسل. انسخ هذه البيانات.

لمعايرة الصور، انتقل إلى شريط القوائم وحدد خصائص الصورة. انسخ المعلومات وانقر فوق موافق. قم بتعيين لوت مفضل للصورة. لتصور كل المكدس في صورة واحدة، انتقل إلى شريط القوائم وحدد صورة، مكدسات، مشروع Z.

في نافذة الإسقاط المعروضة، حدد جميع المكدسات حيث يتم تصور الأوعية. في نوع الإسقاط، اختر متوسط الكثافة وانقر فوق موافق. انتقل إلى شريط القوائم ، الصورة ، الضبط ، السطوع / التباين. انقر على تطبيق واحفظ التغييرات.

انسخ المعلمات المحددة للسطوع والتباين. يجب أن تكون هذه متطابقة لجميع الصور. في شريط القوائم، اختر أداة العصا.

حدد منطقة الشبكية التي تفتقر إلى الأوعية المشكلة. اضغط على T على لوحة المفاتيح لتسجيل المناطق المحددة في إدارة عائد الاستثمار. انقر فوق قياس في إدارة عائد الاستثمار للحصول على معلومات المنطقة اللاوعائية.

كرر هذه الخطوات لقياس المساحة الكلية للشبكية. في شريط القوائم، اختر أداة العصا. قم بتكبير الصورة لتصور الأوعية الجديدة بشكل أفضل.

حدد الأوعية الجديدة واحدة تلو الأخرى باستخدام أداة العصا. اضغط على الحرف T على لوحة المفاتيح لتسجيل المنطقة المحددة في إدارة عائد الاستثمار. انقر فوق قياس في إدارة عائد الاستثمار للحصول على بيانات المنطقة.

في شريط القوائم، حدد أداة الخط المستقيم. قم بتكبير الصورة لتصور جدار الوعاء بشكل أفضل. قم بإجراء ثلاثة خطوط عرضية إلى الوعاء الرئيسي قبل الفرع الأول.

اضغط على T على لوحة المفاتيح لتسجيل المناطق المحددة في إدارة عائد الاستثمار. انقر فوق قياس في إدارة عائد الاستثمار للحصول على بيانات المسافة. في شريط القوائم، انقر فوق أيقونة أداة الخط المستقيم بالزر الأيمن من الماوس وحدد خطا مجزأ.

ارسم خطا داخل الوعاء من العصب البصري حتى تشعب الوعاء الأول ، بعد شكل الأوعية الدموية. اضغط على الحرف T على لوحة المفاتيح لتسجيل المنطقة المحددة في إدارة عائد الاستثمار. في شريط القوائم، حدد أداة الخط المستقيم.

ارسم خطا من العصب البصري حتى تشعب الوعاء الأول. اضغط على الحرف T على لوحة المفاتيح لتسجيل المنطقة المحددة في إدارة عائد الاستثمار. انقر فوق قياس على إدارة عائد الاستثمار للحصول على بيانات المسافات.

باستخدام الأداة البيضاوية لشريط القوائم، حدد مساحة مطبقة بالتساوي على جميع الظروف التجريبية. يجب أن تكون المنطقة المحددة دائرة متحدة المركز مرسومة حول العصب البصري. اضغط على الحرف T على لوحة المفاتيح لتسجيل المنطقة المحددة في إدارة عائد الاستثمار.

يدويا ، عد عدد الفروع الأولية الناشئة عن الأوعية الرئيسية داخل منطقة الاختيار. قم بتحويل الصورة إلى وضع 8 بت. انتقل إلى المكونات الإضافية في شريط القوائم ، وحدد تحليل الوعاء ، كثافة الأوعية الدموية.

حدد مساحة باستخدام أداة المربع في شريط القوائم حيث تريد قياس كثافة الوعاء. انقر فوق موافق. سيعرض البرنامج نافذة جديدة تحتوي على المعلومات المطلوبة. في المثال التجريبي الأول ، تم استخدام نموذج فأر اعتلال الشبكية الناجم عن الأكسجين.

تم إجراء الحقن داخل الجسم الزجاجي في اليوم 12 بعد الولادة لتحديد فعالية الدواء كمضاد لتولد الأوعية. تم استخدام الفئران التي تم حقنها بالسيارة كعنصر تحكم. تعرف المناطق اللاوعائية بأنها المناطق التي تفتقر إلى الأوعية الدموية في الشبكية.

من الصور التي تم الحصول عليها ، يمكن تحديد المناطق اللاوعائية كميا على أنها مجموع المناطق التي لا تحتوي على أوعية تقسم المساحة الكلية لشبكية العين. المناطق ذات الأضرار الميكانيكية تظهر أيضا عدم وجود سفن. لتحديد المناطق المتضررة ، قم بتحليل سلامة الطبقات العصبية مع بقعة Hoechst.

Neovessels هي سفن صغيرة العيار تنشأ من الأوعية الموجودة مسبقا من الضفيرة الوعائية العليا. قمنا بحساب المساحة التي تشغلها خصلات الأوعية الدموية الجديدة عن طريق تحديد مساحة الأوعية الدموية الجديدة في شبكية العين التي تشغلها المساحة الكلية للشبكية. نظرا لأن شكل وحجم الأوعية الجديدة متغيران ، فقد تبدو في بعض الأحيان مشابهة للحطام والتحف.

للتمييز بين الأوعية الجديدة ، تحقق من أن الخصلة تنمو من وعاء ناضج. لتحليل التمدد ، قمنا بقياس قطر الوعاء الرئيسي على ثلاثة ارتفاعات قبل الفرع الأول. يجب على الباحثين تحديد مسافة محددة مسبقا لقياس قطر الوعاء من أجل تقليل التباين بين النتائج.

من الناحية المثالية ، يجب أن تكون أبعد نقطة عن العصب البصري حوالي 300 ميكرومتر. نقترح إجراء التحليل ، وفي وقت لاحق ، بمعدل ستة على الأقل لكل حالة. فيما يتعلق بالالتواء ، نقيس المسافة التي يقطعها الوعاء الرئيسي بعد شكله ، مع احترام مسافة الخط المستقيم بين العصب البصري ونقطة التفرع الأولى.

كما نرى في الصورة ، هناك عدم تجانس في سرعة الأوعية الرئيسية. للحصول على نتيجة تمثيلية ، يجب تحديد كمية لا تقل عن ستة فئران لكل حالة. تم تحليل أحدث المعلمات ، تفرع الأوعية الدموية وكثافتها ، في نموذج متلازمة التمثيل الغذائي الذي يظهر اعتلال الشبكية غير التكاثري.

لقياس تفرع الأوعية الدموية ، حددنا منطقة القياس الكمي عن طريق رسم دائرة متحدة المركز ، ثم قمنا بحساب ، واحدة تلو الأخرى ، الفروع الأولية الناشئة عن وعاء مركزي رئيسي. من الصور التي تم الحصول عليها ، تم تحديد كثافة الأوعية الدموية كميا على أنها المساحة التي تشغلها الأوعية مقسومة على مساحة عائد الاستثمار ، والتي تم وضعها في أماكن مختلفة في كل صورة دقيقة. تجنب تحديد المناطق ذات التلف الميكانيكي.

إذا كان هناك أكثر من منطقتين مع ثقوب ، فيجب التخلص من شبكية العين. باختصار ، في هذه المقالة ، أظهرنا تقنيات كلاسيكية وراسخة وقابلة للتكرار لتحديد بعض المعلمات الأكثر صلة مع مراعاة الممارسة السريرية.