تحضير الطبقات الثنائية الدهنية المدعومة بالخرز لدراسة إنتاج الجسيمات من المشابك المناعية للخلايا التائية

وقد اقتصرت دراسة ناتج المشبك المناعي في الغالب على الطرق المجهرية. قامت BSLBs بتوسيع ذخيرتنا من الأدوات التي يمكن استخدامها لدراسة مخرجات المشابك المناعية للخلايا التائية ، بما في ذلك قياس التدفق الخلوي ، والفحص المجهري ، والبروتينات ، وتقنيات تسلسل الحمض النووي الريبي. على هذا النحو ، يمكن استخدام BSLBs في مجموعة واسعة من أسئلة علم المناعة وفي تحديد التركيب والتنظيم الكيميائي الحيوي لإخراج الخلايا التائية.

ويشمل ذلك ، على سبيل المثال ، دراسة مستقبلات المستضدات الخيمرية ، أو الأدوية التي تمنع مسارات إشارات محددة ، أو الاستئصال الجيني للجينات ذات الاهتمام. أحد الجوانب الأكثر أهمية في هذا البروتوكول هو تحسين معايرات البروتين ولوحة قياس التدفق الخلوي متعددة الألوان اللازمة لتتبع الجسيمات العابرة للمتشابك ذات الاهتمام. وهذا يتطلب التكرار المنهجي لتركيزات البروتين وتركيزات الأجسام المضادة وإعدادات الأداة.

ابدأ بتخفيف ميكرولتر واحد من محلول الخرز مع 1000 ميكرولتر من PBS. عد الخرز باستخدام غرفة مقياس الدم واحسب تركيزها لكل ملليلتر. بعد ذلك ، احسب حجم حبات السيليكا اللازمة ل 500،000 BSLBs النهائي لكل نقطة معايرة.

انقل الحجم المطلوب من حبات السيليكا إلى أنبوب طرد مركزي دقيق معقم سعة 1.5 ملليلتر. اغسل حبات السيليكا ثلاث مرات بملليلتر واحد من PBS المعقم وطرد الخرز مركزيا. تحضير ثلاثة مجلدات من المزيج الرئيسي للجسمات الشحمية التي تحتوي على 12.5 في المئة من الدهون الفوسفاتية المحتوية على النيكل.

استخدم المزيج الرئيسي للشحم لإعادة تعليق حبات السيليكا المغسولة. ثم ، امزجها بلطف عن طريق سحب نصف الحجم الإجمالي لأعلى ولأسفل. باستخدام تقنية معقمة ، أضف غاز الأرجون أو النيتروجين إلى الأنبوب لإزاحة الهواء وحماية الدهون من الأكسدة أثناء الخلط.

أضف الأرجون إلى مخزون الدهون 0.4 ملليمولار. تخزين المخزون والتعامل معه باستخدام تقنية معقمة. حرك BSLBs إلى الخلاط الرأسي واخلطها لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة باستخدام الخلط المداري عند 10 دورات في الدقيقة.

ثم ، قم بتدوير الخرز عن طريق الطرد المركزي لمدة 15 ثانية في درجة حرارة الغرفة على جهاز طرد مركزي صغير على مقاعد البدلاء. قم بحظر BSLBs المشكلة عن طريق إضافة ملليلتر واحد من 5٪ BSA يحتوي على 100 ميكرومول من كبريتات النيكل لتشبع مواقع NTA على BSLBs. اغسل ثلاث مرات باستخدام المخزن المؤقت HBS-HSA لإزالة محلول الحجب الزائد.

خذ صفيحة U-bottom أو V-bottom 96-well جديدة وقم بإعداد تخفيفات تسلسلية مزدوجة للبروتينات. أعد تعليق BSLBs المحضرة في وحدة تخزين بحيث تحتوي 100 ميكرولتر من المخزن المؤقت HBS-HSA على 500،000 BSLBs. بعد ذلك ، خذ لوحة أخرى من U-bottom أو V-bottom 96-well وانقل 100 ميكرولتر من تعليق BSLB إلى الآبار بطريقة تتلقى كل بئر 500،000 BSBLs.

قم بتدوير اللوحة الثانية في درجة حرارة الغرفة لمدة دقيقتين عند 300x G.تخلص من المادة الفائقة وانقل أحجام 100 ميكرولتر من لوحة معايرة البروتين إلى اللوحة التي تحتوي على BSLBs الرسوبية. استخدم رقائق الألومنيوم لحمايتها من الضوء واحتضنها في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة عند 1000 دورة في الدقيقة.

ثم اغسل اللوحة ثلاث مرات عن طريق إضافة مخزن مؤقت HBS-HSA إلى اللوحة وقم بتدويرها في درجة حرارة الغرفة لمدة دقيقتين عند 300x G.Count الخلايا بعد الغسيل. ثم قم بتخفيفها إلى تركيز نهائي قدره 2.5 مليون لكل ملليلتر باستخدام وسيط فحص النقل المتشابك. بمجرد تحميل BSLBs بمزيج البروتين ، اغسل BSLBs مرتين باستخدام المخزن المؤقت HBS-HSA لإزالة البروتينات الزائدة غير المقيدة.

إعادة تعليق 500،000 BSLBs لكل بئر في 200 ميكرولتر من المخزن المؤقت HBS-HSA. انقل 100 ميكرولتر من BSLBs لكل بئر إلى لوحة جديدة من 96 بئرا ذات قاع U لعمل نسخة مكررة ، بحيث تكون الكمية النهائية من BSLB لكل بئر هي 250،000. قم بتدوير BSLBs بسرعة 300x G لمدة دقيقتين في درجة حرارة الغرفة.

تخلص من السوبرناتانت ثم أعد تعليق BSLBs باستخدام 100 ميكرولتر من تعليق الخلايا التائية. تخلط بلطف لمنع تشكيل الفقاعات. احتضان الثقافات المشتركة لمدة 90 دقيقة عند 37 درجة مئوية.

حماية الخلايا من الضوء وتبريد الثقافات المشتركة عن طريق احتضانها أولا في درجة حرارة الغرفة لمدة لا تقل عن 15 دقيقة. الطرد المركزي للمزارع المشتركة في درجة حرارة الغرفة لمدة خمس دقائق في 500x G.تخلص من supernatant وأعد تعليق الثقافات المشتركة في الكالسيوم والمغنيسيوم الخالية من الأيونات 2٪ BSA PBS في درجة حرارة الغرفة للحظر. ضع الخلايا على الثلج لمدة 45 دقيقة وقم بحمايتها من الضوء.

قم بإعداد المزيج الرئيسي للأجسام المضادة باستخدام الثلج البارد بنسبة 0.22 ميكرومتر مصفى بنسبة 2٪ BSA و PBS كمخزن مؤقت للتلطيخ. سيوفر هذا المزيج الرئيسي حظرا إضافيا. قم بتدوير الثقافات المشتركة عند 500x G لمدة خمس دقائق وأربع درجات مئوية.

تخلص من المواد الخارقة ، ثم استخدم ماصة متعددة القنوات لإعادة تعليق الخلايا في المزيج الرئيسي الملون الذي يحتوي على تركيزات الأجسام المضادة المحسنة. قم بتضمين الخلايا ذات العلامات المتساوية و BSLBs ، و BSLBs الفلورية وغير الفلورية ، والخلايا و BSLBs الملطخة وحدها. اخلطي بلطف عن طريق سحب نصف الحجم لأعلى ولأسفل.

احتضان لمدة 30 دقيقة على الجليد وحمايتها من الضوء. اغسل الخلايا و BSLBs مرتين باستخدام 2٪ BSA PBS البارد المثلج. قم بتدويرها بسرعة 500 × G لمدة خمس دقائق عند أربع درجات مئوية.

بعد الطرد المركزي ، تحقق من الاستزراع المشترك المترسب في قاع الآبار. ثم ، أعد تعليق الثقافات المشتركة المغسولة في 100 ميكرولتر من PBS واحصل عليها على الفور. قم بتنشيط مقياس السجل للضوء المتناثر على الجانب ومعلمة وقت الطيران للأضواء الجانبية والأمامية.

احصل على معايير MESF ، مما يضمن سقوط كل من المجموعات الخافتة والأكثر سطوعا في النطاق الخطي للأداة. بعد ذلك ، احصل على عينات التعويض ، واحسب التعويض ، وطبق مصفوفة التعويض على التجربة. احصل على ما لا يقل عن 20،000 معيار MESF إجمالي وحفظه لكل قناة قياس كمي.

تجنب استخدام سائل غمد FACS أو ما شابه ذلك لإعادة تعليق حبات MESF ، لأنها تحتوي على أملاح وكحول من شأنها تدمير الفلوروكرومات ، مما يؤدي إلى قمم تألق أوسع وخطأ كبير. للاقتناء باستخدام أجهزة أخذ العينات عالية الإنتاجية ، قم بتعيين اكتساب الأدوات إلى قياسي ، واضبط الحصول على العينة على 80 ميكرولتر. معدل تدفق العينة بين اثنين وثلاثة ميكرولترات في الثانية ، حجم خلط العينة عند 50 ميكرولتر ، خلط العينة 150 ميكرولتر في الثانية ، والخلط لكل بئر بين ثلاثة وخمسة.

احصل على ما لا يقل عن 10،000 BSLBs واحدة لكل عينة. وأخيرا، تصدير ملفات FCS. يظهر هنا مثال على قياسات قياس التدفق الخلوي الكمي ل ICAM-1 على سطح الخلايا البائية اللوزتين والخلايا التائية المساعدة.

تصف الصور التمثيلية استراتيجية البوابة لتحليل خلايا CXCR5 B المفردة والخلايا التائية المساعدة الجريبية المعزولة من اللوزتين الحنكية البشرية. تحدد استراتيجية البوابة المتسلسلة هذه الأحداث الحية الفردية داخل نافذة الاستحواذ المستمر. يتم عرض الثنائيات ، التعبير عن سطح الخلية من ICAM-1 مقارنة بضوابط FMO وضوابط FMO الموسومة بأنماط متساوية ذات صلة من السكان ، هنا.

يتم عرض بوابات وقياس مؤسسات التمويل الأصغر من مجموعات MESF القياسية المختلفة في المدرج التكراري المتراكب لمجموعات MESF هنا. تمثل القيم مؤسسات التمويل الأصغر لكل مجموعة من مجموعات MESF الخمسة. يتم عرض الانحدار الخطي ل MESF على cMFI لسكان MESF هنا.

يستخرج المنحدر MESF المرتبط بالخلايا من بيانات FCM الخاصة ب ICAM-1 على سطح الخلايا البائية اللوزتين في TFH. يتبع التحويل إلى الكثافات الجزيئية المطلقة هذه العمليات الرياضية البسيطة. تظهر الصور التمثيلية تحليل قياس التدفق الخلوي ل BSLBs المعاد تشكيلها مع زيادة كثافة الهيستيدات الأحادية المؤتلفة ICAM-1 12.

تظهر هنا تحليلات الانحدار للتركيز المرجعي ICAM-1 على الكثافة المقاسة. يستخدم المنحدر لحساب التركيزات المستهدفة من البروتين لتحقيق كثافة الخلايا. توضح مخططات التدفق الخطوات الحاسمة للمشاركة في زراعة الخلايا التائية مع BSLBs ، وإعادة تشكيل أغشية النموذج في القياس اللاحق لنقل الجسيمات باستخدام قياس التدفق الخلوي.

يتم عرض استراتيجية البوابة لتحديد BSLBs الفردية والخلايا داخل نافذة الاستحواذ المستمر هنا. أحد أهم جوانب هذا البروتوكول هو أنه للحفاظ على قابلية تكرار النتائج ، في كل مرة تقوم فيها بتغيير مخزون البروتين أو الدهون ، تحتاج إلى إجراء تحليل معايرة جديد. لاكتشاف جزيئات فعالة جديدة تفرزها مجموعات فرعية مختلفة من الخلايا التائية ، يمكن عزل BSLBs بشكل أكبر عن طريق فرز الخلايا المنشطة بالفلور كما تخضع للتحليل النسخي والبروتيني.

استخدم زملاؤنا في جامعة أكسفورد هذه التكنولوجيا لدراسة وإظهار تفاعلات جديدة بين المستقبلات والروابط ، وكذلك لدراسة آثار الاجتثاث الجيني على مخرجات المشبك المناعي للخلايا التائية.