نمط الكائنات الحية الدقيقة والجسيمات الدقيقة من خلال التجميع المتسلسل بمساعدة الشعيرات الدموية
November 4th, 2021
نحن نقدم تقنية تستخدم التجميع بمساعدة الشعيرات الدموية في منصة الموائع الدقيقة لنمط الأجسام الصغيرة الحجم المعلقة في سائل ، مثل البكتيريا والغرويات ، في صفائف موصوفة على ركيزة polydimethylsiloxane.
تسمح هذه الطريقة بإنتاج أنماط محددة من قبل المستخدم من الكائنات الحية الدقيقة داخل قناة الموائع الدقيقة. بمجرد أن يتم نقوشها ، يمكن مراقبة الكائنات الحية الدقيقة لتقييم فسيولوجيتها طويلة الأجل وتفاعلها مع الإنتاجية العالية. يتيح استخدام القوى الشعرية مسارا غير محدد للنقش ، والذي ينطبق عبر فئات مختلفة من المواد.
على سبيل المثال ، الجسيمات الغروية والبكتيريا. علاوة على ذلك ، فإنه يسمح بإنتاج صفائف كبيرة مع تحكم رائع في الترتيب المكاني للمواد ذات الاهتمام. حتى الآن ، اختبرنا وطبقنا الطريقة على الجسيمات الغروية والخلايا الميكروبية.
ونتيجة لذلك ، يمكن أن تجد تطبيقات في هندسة المواد والمجالات التي تتطلب تحليلا كميا أحادي الخلية مثل فحص الأدوية. للبدء ، قم بإعداد خليط PDMS عن طريق خلط المطاط الصناعي مع عامل الربط المتقاطع. ثم حرك الخليط بقوة لمزج المكونين بشكل موحد حتى تتشكل فقاعات الهواء ويبدو خليط PDMS غير شفاف.
الآن ، قم بإزالة الخليط في مجفف فراغ حتى تتم إزالة جميع فقاعات الهواء ويبدو الخليط شفافا مرة أخرى. للحصول على أرضية قالب بسماكة 400 ميكرومتر من رقاقة الموائع الدقيقة ، صب ثلاثة غرامات من الخليط على سيد السيليكون وضع سيد السيليكون على معطف دوار لتدوير معطف في 21 مرة G لمدة خمس ثوان و 54 مرة G لمدة 10 ثوان. Degas مرة أخرى لإزالة فقاعات الهواء المحاصرة كما هو موضح سابقا.
صب 20 غراما من خليط PDMS في القالب المطبوع ثلاثي الأبعاد لصنع القناة الدقيقة التي ستكون بمثابة سقف رقاقة الموائع الدقيقة وتفكيكها لمدة 30 دقيقة كما هو موضح سابقا. اخبز رقاقة السيليكون والقالب المطبوع ثلاثي الأبعاد عند 70 درجة مئوية لمدة ساعتين على الأقل ، ثم اقطع PDMS على طول الخطوط العريضة للقالب المطبوع ثلاثي الأبعاد وقشره. قطع PDMS مع شفرة حول القنوات الدقيقة ولكم الثقوب التي ستكون بمثابة مدخل ومخرج للقناة microfluidic.
الآن قم بقطع PDMS وقشره من سيد السيليكون وقطع طبقة PDMS إلى قطع أصغر بنفس أبعاد قنوات الموائع الدقيقة التي سيتم ربطها أعلى القوالب. افرك القوالب والقنوات الدقيقة بلطف باستخدام محلول منظف بنسبة 1٪ لمدة خمس دقائق ثم اشطفها بالماء منزوع الأيونات. بعد ذلك ، شطف القوالب والقنوات الدقيقة باستخدام الأيزوبروبانول ، قبل شطفها بالماء منزوع الأيونات.
الآن قم بتجفيف القوالب والقنوات الدقيقة في درجة حرارة الغرفة لمدة دقيقة واحدة مع الهواء المضغوط في شريط واحد. ضع القوالب والقنوات الدقيقة في منظف البلازما مع توجيه أسطح الترابط لأعلى. بعد تشغيل منظف البلازما ، تعالج البلازما القوالب والقنوات الدقيقة لمدة 40 ثانية ، ثم تخرجها من منظف البلازما وتربط على الفور القنوات الدقيقة أعلى القوالب.
قم بتخزين رقائق الموائع الدقيقة في فرن على درجة حرارة 70 درجة مئوية لمدة خمسة أيام لضمان استعادة PDMS الكارهة للماء. في يوم التجربة، اضبط الحاضنة الصندوقية على 37 درجة مئوية قبل عدة ساعات من التجربة، ثم قم بإعداد مضخة المحقنة والصفيحة الزجاجية المسخنة على مسرح المجهر، مع ضبط نفس درجة حرارة حاضنة الصندوق. قبل 90 دقيقة من التجربة ، ضع شريحة الموائع الدقيقة في وعاء مملوء بالإيثانول بنسبة 100٪ واغسل القناة بالإيثانول بنسبة 100٪ لمدة 10 دقائق على الأقل ، ثم ضع شريحة الموائع الدقيقة في مجفف فراغ و degas لمدة 30 دقيقة على الأقل.
الآن تبادل الإيثانول مع الماء المقطر وفراغ علاج رقاقة لمدة 30 دقيقة على الأقل. ضع رقاقة الموائع الدقيقة في الفرن على حرارة 70 درجة مئوية لمدة 10 دقائق لإزالة أي آثار للسائل المتبقي في القناة. ماصة واحدة ملليلتر من MOPS المتوسطة في قارورة جهاز طرد مركزي وإضافة 10 ميكرولتر من 0.132 فوسفات البوتاسيوم المولي.
Aliquot 100 ميكرولتر من الثقافة بين عشية وضحاها في قارورة أجهزة الطرد المركزي وأجهزة الطرد المركزي للثقافة في 2،300 مرة G لمدة دقيقتين. تخلص بلطف من السوبرناتانت لإعادة تعليق الكريات في ملليلتر واحد من MOPS الطازج المتوسط مع 0.015٪ من Tween 20 و 0.01٪ من فوسفات البوتاسيوم وتحميل التعليق البكتيري في حقنة ملليلتر واحد. لتأمين المحقنة واتصال الأنابيب، أدخل إبرة مباشرة في الأنابيب.
الآن قم بتركيب المحقنة على مضخة المحقنة وحقن التعليق في شريحة الموائع الدقيقة من خلال المدخل الموجود في الجزء العلوي من القناة حتى يغطي التعليق منطقة القالب بالفخاخ. اضبط مضخة المحقنة بمعدل تدفق يتراوح من 0.07 إلى 0.2 ميكرولتر في الدقيقة لسحب التعليق البكتيري ومراقبة عملية النقش عبر برنامج المجهر. بمجرد أن يتم نقش القالب بالخلايا ، قم بزيادة معدل تدفق السحب لإفراغ قناة الموائع الدقيقة بسرعة وغسلها ب LB الطازج الذي تم تفكيكه مسبقا لمدة 30 دقيقة على الأقل وتسخينه مسبقا عند 30 درجة مئوية.
الآن اضبط مضخة المحقنة بمعدل تدفق يبلغ ميكرولترين في الدقيقة لطرد القناة بلطف. بمجرد ملء القناة ، قم بزيادة معدل التدفق مرة أخرى. احصل على صور للبكتيريا النامية في التكبير المطلوب والفاصل الزمني.
ماصة 900 ميكرولتر من محلول مائي Tween 20 بنسبة 0.015٪ في قارورة جهاز طرد مركزي ثم ماصة 100 ميكرولتر من التعليق الغروي الأصلي فيها. قم بالطرد المركزي للتعليق عند 13،500 مرة G لمدة دقيقة واحدة واستبدل بلطف الفائق بمحلول Tween 20 المائي. قم بتحميل التعليق الغروي في حقنة ملليلتر واحدة وقم بتوصيل المحقنة بالشريحة من خلال أنابيب الموائع الدقيقة.
حقن التعليق في رقاقة الموائع الدقيقة من خلال المدخل الموجود داخل القسم المركزي في الجزء العلوي من القناة وادفع التعليق تدريجيا حتى يتم تغطية القالب. اسحب التعليق الغروي بمعدل تدفق يتراوح بين 0.07 و 0.2 ميكرولتر في الدقيقة وصور عملية النقش عبر برنامج المجهر. قم بزيادة معدل التدفق بمجرد وصول الغضروف المفصلي إلى نهاية القالب بسرعة.
تم استغلال هندسة القناة المستقيمة لنمط الخلايا المرحلية الثابتة لسلالة الإشريكية القولونية الفلورية التي ترسب 83٪ من الفخاخ التي تم تحليلها والتي تم تحليلها والتي تم تحليلها. استأنفت البكتيريا المنقوشة النمو في أوقات مختلفة في غضون 1.5 ساعة من الوقت الذي امتلأت فيه القناة ب LB الطازج. بمجرد استئناف النمو ، بدأت الخلايا البكتيرية المفردة في تكوين مستعمرات فردية توسعت حتى تشكلت طبقة سطحية وفقدت دقة الخلية الواحدة. أظهر التحليل الذي أجري على أكثر من 55000 فخ أن الدايمرات الخضراء والحمراء التي صنعتها جسيمتان قطرهما ميكرومتر وميكرومتر واحد تشكلت في 93٪ و 89٪ من الفخاخ التي تم تحليلها على التوالي.
وتشكلت أدوات تشذيب خضراء حمراء خضراء في 52٪ من الفخاخ. يمكن التحكم بدقة في المسافة بين الجسيمات المنقوشة عن طريق إجراء ترسبين في اتجاهين متعاكسين ، وبالتالي محاصرة هذه الجسيمات في الأطراف المقابلة لكل فخ. من المهم ضمان درجة حرارة موحدة عبر القالب لمنع التكثيف أثناء عملية النقش.
تحقيقا لهذه الغاية ، نضع لوحة زجاجية ساخنة أسفل القالب ونضعها في نفس درجة حرارة حاضنة الصندوق. يمكن استخدام هذه الطريقة في مجموعة متنوعة من الدراسات البيولوجية التي تنطوي على التحليل الكمي للخلية الواحدة. ميزة فريدة من نوعها هي أن طبيعتها الإنتاجية العالية التي تسمح بنقش الآلاف من الخلايا التي توفر إحصاءات كبيرة داخل نفس الساحة التجريبية.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
نظرة عامة
تقدم هذه الدراسة منصة ميكروفلويدية تستخدم التجميع بمساعدة التماسك الشعري لتشكيل كائنات مجهرية، مثل البكتيريا والجسيمات المشتتة، في صفوف محددة. تتيح هذه الطريقة مراقبة الفسيولوجيا والتفاعلات طويلة الأمد للكائنات الحية الدقيقة.
مكونات الدراسة الرئيسية
مجال العلم
- الميكروفلويديات
- التكنولوجيا الحيوية
- علم الأحياء الدقيقة
الخلفية
- تمكن قنوات الميكروفلويديات من التحكم الدقيق في الكميات الصغيرة من السوائل.
- يمكن تسخير القوى الشعرية لتشكيل مواد مختلفة.
- فهم سلوك الكائنات الحية الدقيقة أمر بالغ الأهمية للعديد من التطبيقات.
- قد تفتقر الطرق الحالية إلى المرونة للنصوص المحددة من قبل المستخدم.
هدف الدراسة
- تطوير طريقة لإنتاج أنماط محددة من قبل المستخدم للكائنات الحية الدقيقة.
- لتقييم الفسيولوجيا طويلة الأمد للكائنات الحية الدقيقة المحددة.
- لاستكشاف قابلية تطبيق القوى الشعرية عبر فئات مختلفة من المواد.
الطرق المستخدمة
- التجميع بمساعدة التماسك الشعري في قنوات الميكروفلويديات.
- تشكيل الجسيمات المشتتة والخلايا الميكروبية.
- مراقبة الكائنات الحية الدقيقة بعد التشكيل.
- تقييم التحكم في الترتيب المكاني.
النتائج الرئيسية
- تم إنشاء أنماط محددة من قبل المستخدم للكائنات الحية الدقيقة بنجاح.
- أظهرت الطريقة التحكم في الترتيب المكاني للمواد.
- كانت المراقبة طويلة الأمد للكائنات الحية الدقيقة ممكنة.
- وفرت القوى الشعرية نهجًا متنوعًا للعديد من المواد.
الاستنتاجات
- توفر هذه التقنية نهجًا جديدًا لتشكيل الكائنات الحية الدقيقة.
- لها تطبيقات محتملة في دراسة التفاعلات الميكروبية.
- الطريقة قابلة للتكيف لأنواع مختلفة من المواد.
الأسئلة الشائعة
Executive Industry Relevance
This microfluidic platform enables high-throughput, user-defined patterning of microorganisms and microparticles, supporting quantitative single-cell analysis in drug discovery and microbial ecology studies. By combining geometric control with environmental modulation, it enhances predictive confidence in target validation and phenotypic screening workflows. The method addresses a key discovery-stage challenge: achieving reproducible spatial arrangements for mechanistic de-risking of microbial interactions.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses through precise spatial patterning of microbial strains for interaction studies.
- Operational Value: Supports biological de-risking by allowing controlled co-culture configurations to clarify pathway dependencies.
- Predictive Value: Facilitates portfolio triage by generating quantitative data on distance-dependent microbe-microbe interactions under defined conditions.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Prepares validated biological systems for downstream workflows by depositing thousands of individual cells with high spatial fidelity.
- Operational Value: Addresses assay standardization and reproducibility through capillary-force-driven patterning applicable across material classes.
- Screening Readiness: Enables reliable compound evaluation by providing large arrays of patterned microorganisms for high-throughput monitoring.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Supports disease-relevant systems by coupling single-cell deposition with microfluidic environmental control for microbial physiology studies.
- Risk-Adjusted Advancement: Connects discovery through preclinical validation by enabling long-term monitoring of growth and colony formation post-patterning.
- Predictive De-risking: Focuses on mechanistic insights from patterned arrays, such as green-red dimer and trimer formation rates, to inform translational decisions.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into the discovery continuum from Early Discovery to Lead Identification, supporting hypothesis testing and assay readiness for antimicrobial or probiotic candidate evaluation.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by enabling controlled patterning of microbial strains to study interaction dynamics.
- Screening: Describes assay readiness through high-throughput patterning of microorganisms, allowing quantitative imaging of growth and interaction over time.
- Analytics: Highlights quantitative outputs such as trap occupancy rates (e.g., 83% for E. coli, 93% for 2μm particles) that help compare conditions and material behaviors.
- Translational Research: Connects to preclinical continuity by enabling long-term physiology monitoring under controlled environmental conditions, relevant for microbial ecology translation.
- Enterprise Reuse: Frames the method as a reusable platform for patterning diverse materials, including bacteria and colloids, across multiple projects.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence in target validation, reduction of mechanistic ambiguity in microbial interactions.
- Operational Value: Standardization, reproducibility, and scalability of patterning across microbial and colloidal systems.
- Strategic Value: Better go/no-go decisions, capital efficiency, and reduced late-stage biological risk in antimicrobial development.
- Portfolio Impact: Risk-adjusted prioritization and advancement decisions based on quantitative single-cell interaction data.
Implementation Considerations
- Requires expertise in microfluidic device fabrication, plasma bonding, and hydrophobic recovery of PDMS.
- Depends on instrumentation including syringe pumps, heated stages, plasma cleaners, and microscopy systems for patterning and monitoring.
- Necessitates cross-team standardization of channel preparation, bacterial suspension handling, and environmental control protocols.
- Involves adaptation considerations for different microorganism sizes, growth rates, and colloidal material properties.
- Includes practical limitations such as the need for uniform temperature to prevent condensation and potential loss of single-cell resolution during colony expansion.
