شريحة موائع دقيقة بسيطة للنمو على المدى الطويل وتصوير Caenorhabditis elegans

الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أن الحيوان يمكن أن ينمو بحرية داخل الجهاز ويمكن أن يكون محاصرا للتصوير عالي الدقة. يمكن إعادة استخدام الجهاز عدة مرات. أثناء صنع الجهاز ، النظافة هي العامل الأكثر أهمية لتكون قادرا على تصنيع أجهزة خالية من الغبار لتجنب التسرب أثناء عمليات الجهاز.

لبدء تصميم النمط الأول لطبقة التدفق والنمط الثاني لطبقة التحكم باستخدام أشكال مستطيلة في برنامج معالجة النصوص وطباعة أقنعة الصور بمساعدة راسمة ليزر بحد أدنى لحجم الميزة يبلغ ثمانية ميكرومتر على فيلم قائم على البوليستر. قطع رقائق السيليكون إلى قطع مربعة من 2.5 سم في الطول والعرض. نظفها ب 20٪ هيدروكسيد البوتاسيوم لمدة دقيقة واحدة واشطف الرقائق بالماء منزوع الأيونات.

استخدم رقاقة واحدة للتدفق والأخرى لطبقة التحكم. جفف القطع بغاز النيتروجين المضغوط 14 P-S-I متبوعا بالجفاف على صفيحة ساخنة عند 120 درجة مئوية لمدة أربع ساعات. بعد التبريد ، خذ قطعة سيليكون واحدة ، وضعها على ظرف مبرمج الدوران وقم بتشغيل المكنسة الكهربائية لتثبيت الرقاقة في مكانها.

ضع ما يقرب من 20 ميكرولتر من سداسي ميثيل ديسيلان على قطعة السيليكون وقم بتغطيتها باستخدام مبرمج الدوران عند 500 R-P-M لمدة خمس ثوان متبوعة ب 3000 R-P-M لمدة 30 ثانية. للحصول على سمك موحد مقاوم للضوء يبلغ حوالي 40 ميكرومتر خاص بطبقة التدفق ، قم بطلاء رقاقة السيليكون بحوالي 1.5 ملليلتر من المقاومة الضوئية السلبية باستخدام مبرمج الدوران عند 500 R-P-M لمدة خمس ثوان متبوعة ب 2000 R-P-M لمدة 30 ثانية. كرر طلاء قطعة السيليكون باستخدام سداسي ميثيل ديسيلان ومقاوم ضوئي سلبي للرقاقة الثانية للحصول على سمك موحد مقاوم للضوء يبلغ حوالي 40 ميكرومتر خاص بطبقة التحكم.

بدلا من ذلك ، لزيادة سمك طبقة التدفق إلى ما يقرب من 80 ميكرومتر للحيوانات الأكبر سنا ، قم بتغطية رقائق السيليكون بحوالي 1.5 ملليلتر من المقاومة الضوئية السلبية ، باستخدام مبرمج الدوران عند 500 R-P-M لمدة خمس ثوان متبوعة ب 2000 R-P-M لمدة 30 ثانية. اخبز قطعتي السيليكون المطلية سابقا المقاومة للضوء على طبق ساخن عند 65 درجة مئوية لمدة دقيقة واحدة تليها 95 درجة مئوية لمدة 10 دقائق. بعد التبريد ، ضع قطع السيليكون المخبوزة الناعمة على مرحلة التعرض لمصباح U-V مع السطح المطلي المقاوم للضوء الذي يواجه مصباح U-V.

قم بتعريض القطعتين بشكل منفصل ل U-V لمدة 15 ثانية باستخدام مصباح 200 واط من خلال قناع صور بنمطين واحد واثنين للحصول على طبقات التدفق والتحكم على التوالي. اخبز قطعتي السيليكون المكشوفتين كما هو موضح سابقا مع توجيه الطبقات المطلية لأعلى. بعد تبريد القطع ، قم بتطوير الأنماط عن طريق نقع قطع السيليكون في محلول المطور المقاوم للضوء لمدة 20 دقيقة.

بمجرد أن يصبح النمط مرئيا ، اشطف القطع بكحول الأيزوبروبيل النقي وجففها برفق باستخدام غاز النيتروجين. احتفظ بقطع السيليكون في مجفف مع توجيه السطح المطلي لأعلى. قم بتعريض القطع لأبخرة السيلان عن طريق سكب 50 ميكرولتر من T-C-P-F-O-S النقي على شريحة زجاجية.

ضع الشريحة داخل مجفف واحتضانها لمدة ساعتين. اصنع P-D-M-S في كوب بلاستيكي عن طريق خلط قاعدة المطاط الصناعي مع عامل المعالجة وحركه باستمرار لمدة ثلاث دقائق. قم بإزالة الغاز من مزيج P-D-M-S في مجفف لمدة 30 دقيقة لإزالة جميع فقاعات الهواء.

ضع طبقة التحكم في رقائق السيليكون في طبق بتري واسكب طبقة مزيج P-D-M-S بسمك خمسة ملليمترات على قطع السيليكون. بعد عملية صب P-D-M-S ، كرر تفريغ مزيج P-D-M-S. ضع رقاقة السيليكون مع طبقة التدفق في مواجهة الشاحنة الدوارة التي تطبق ضغط فراغ من 200 إلى 500 مللي تور.

صب ما يقرب من ملليلتر واحد من P-D-M-S على رقاقة السيليكون. قم بترميزه باستخدام طبقة تدور للحصول على طبقة بسمك 80 ميكرومتر تقريبا. اخبز رقاقتي السيليكون مع طبقة P-D-M-S المغلفة بالدوران وسكب طبقات P-D-M-S عند 50 درجة مئوية في فرن حراري بالهواء الساخن لمدة ست ساعات.

بعد تبريد القطع ، قم بقطع طبقة P-D-M-S بسمك خمسة ملليمترات من قطعة السيليكون حول طبقة التحكم باستخدام شفرة حادة وقشرها من ركيزة السيليكون. قم بعمل فتحتين بقطر ملليمتر واحد تقريبا باستخدام مثقاب هاريس في خزان كتلة P-D-M-S لتوصيل قناة التثبيت ومداخل قناة العزل بخطوط الغاز لانحرافات غشاء P-D-M-S. ضع قطعة السيليكون مع طبقة P-D-M-S المطلية بالدوران على النمط الأول بحيث يكون السطح المطلي ب P-D-M-S متجها لأعلى على صينية بلاستيكية.

حافظ على كتلة P-D-M-S المثقوبة بالنمط الثاني على الدرج مع توجيه الجانب المصبوب لأعلى. احتفظ بالدرج البلاستيكي داخل منظف البلازما وفضح سطحي P-D-M-S إلى بلازما هواء بقوة 18 واط لمدة دقيقتين عن طريق تطبيق فراغ منخفض. أخرج الكتلتين المعالجتين بالبلازما واربط الكتل برفق عن طريق الضغط على الأسطح المعالجة بالبلازما من النمطين الأول والثاني معا.

اخبز الأنماط المستعبدة عند 50 درجة مئوية لمدة ساعتين في فرن حراري بالهواء الساخن. بعد إخراج الجهاز المستعبدين من الفرن ، قم بقصه من رقاقة السيليكون بالنمط الأول والنمط الثاني وقم بعمل ثقوب في خزانات مدخل ومخرج طبقة التدفق باستخدام أداة ثقب Harris. ضع كتلة P-D-M-S المستعبدة بحيث تكون طبقة التدفق متجهة لأعلى على صينية بلاستيكية واحتفظ بغطاء زجاجي نظيف على نفس الدرج.

قم بتعريض الكتل الموجودة في غطاء الزجاج إلى بلازما هواء 18 وات لمدة دقيقتين. اضبط ضغط الفراغ لرؤية غرفة بنفسجية. ضع كتلة P-D-M-S المكشوفة بالبلازما على زجاج الغطاء واخبز الهيكل المستعبدين في فرن على حرارة 50 درجة مئوية لمدة ساعتين.

قم بتخزين الجهاز في غرفة نظيفة لأي تجربة مستقبلية. خذ الجهاز ، ضعه على مجهر ستيريو وأرفق الأنابيب. قم بتوصيل أنبوب microflex بخط غاز النيتروجين المضغوط وموصل ثلاثي الاتجاهات على الطرف الآخر.

قم بتوصيل الأنابيب واحد واثنين من الموصلات ثلاثية الاتجاهات بالمصيدة في عزل الأغشية على التوالي. قم بتوصيل أنبوبين microflex بمنفذي مخرج محبس ثلاثي الاتجاهات. قم بتوصيل الطرف الآخر من الأنبوبين بإبرة قياس 18 بطول ثمانية ملليمترات.

املأ طبقة التدفق بمخزن M-9 باستخدام ماصة صغيرة عبر منفذ المدخل. املأ كلا الأنبوبين بالماء منزوع الأيونات من خلال الطرف المتصل بالإبرة. أدخل الإبرتين في الثقوب المثقوبة التي تربط غشاء العزل والمحاصرة.

افتح منظم غاز النيتروجين عند 14 P-S-I وقم بتدوير الصمام ثلاثي الاتجاهات من الأنبوب الأول لدفع الماء إلى الجهاز عبر قنوات الموائع الدقيقة في طبقات التحكم ، وهي أغشية المصيدة والعزل. حرر الضغط باستخدام محبس ثلاثي الاتجاهات ، بمجرد ملء القنوات بالماء وتجهيزها. قم بإزالة الفقاعات عن طريق تدفق وسائط إضافية عبر قناة التدفق.

يوضح الشكل صورا ل P-S-3-2-3-9 ، ينمو داخل رقاقة الموائع الدقيقة ويجمد كل ثماني إلى 10 ساعات لالتقاط صور مضانة. يمثل التباين في نمط التعبير مثالا على تنظيم الجينات الزمنية حيث يتم التعبير عن نفس الجين في خلايا مختلفة في مراحل مختلفة من التطور. يظهر تصوير النمط الجيني الفردي W-D-I-S-5-1 من caenorhabditis elegans بنية تغصنية متفرعة تشبه الشمعدان في كل خلية عصبية P-V-D تضم عمليات أولية وثانوية ثلاثية ورباعية في مراحل النمو L-2 و Late L-2 و L-3 و L-4 على التوالي.

يقارن الشكل هنا بين تطوير P-V-D والحيوانات المزروعة بالأجهزة ، وتلك التي تزرع على ألواح N-G-M. زادت أعداد S-P و Q-P في مراحل مختلفة من تطور الدودة مع تقدم العمر. تم علاج Caenorhabditis elegans بقطرة من ثلاثة ليفاميزول مليمولار لإحداث شلل كاف مطلوب للتصوير عالي الدقة.

لم تكن قيم S-P مختلفة بشكل كبير عند قياسها من الحيوانات المرحلية المماثلة التي نمت على ألواح N-G-M وتم تصويرها باستخدام ثلاثة ليفاميزول مليمولار على شريحة أجار. علاوة على ذلك ، تزداد المسافة بين جسمي الخلية P-V-C ، أحدهما موجود في الذيل ، والثاني موجود بالقرب من الفرج ، مع تحركهما بعيدا في كل من الحيوانات المزروعة في الجهاز وتلك التي تزرع على ألواح N-G-M. يمثل الشكل الصورة عالية الدقة للخلايا العصبية المستقبلة التي تعمل باللمس من الحيوانات التي تنمو داخل جهاز الموائع الدقيقة.

يمثل المونتاج العملية العصبية P-L-M-R بأكملها في نقاط زمنية متتالية تسلط الضوء على الميتوكوندريا والعملية العصبية. يمثل التمثيل البياني الطول الكلي للعملية العصبية التي لوحظ أنها تزداد مع ميل مقداره 10.4 ميكرومتر في الساعة. يستخدم الجهاز الدقيق الصنع غشاء P-D-M-S رقيقا ينحرف في وجود غاز النيتروجين عالي الضغط لشل حركة C-elegans وتثبيتها في مكانها للتصوير عالي الدقة.

يمكن أن يتيح هذا الإجراء إجراء دراسات طولية للعمليات الخلوية ودون الخلوية في C-elegans التي تحتاج إلى ملاحظات متقطعة على مدى فترة طويلة من الزمن.