DetectSyn: طريقة فلورسنت سريعة وغير متحيزة للكشف عن التغيرات في كثافة المشبك

يستفيد DetectSyn من تقنية مقايسة ربط القرب لتحديد التغييرات التي تطرأ على نقاط الاشتباك العصبي بسرعة. كما نقدم بروتوكولا لتحليل النتائج. الميزة الرئيسية ل DetectSyn هي مدى سرعة الحصول على النتائج في المناطق الكبيرة من الأنسجة التي يمكن تحليلها.

للبدء ، قم بإزالة محلول الحجب بعناية باستخدام ماصة باستور بلاستيكية دون إزعاج الخلايا. ثم قم بخط طبق بتري بلاستيكي كبير مع Parafilm. وباستخدام الملقط ، انقل زلات الغطاء بعناية إلى Parafilm.

أضف 60 ميكرولتر من محلول الأجسام المضادة الأساسي إلى الجزء العلوي من زلة الغطاء ، مما يضمن عدم تسرب محلول الأجسام المضادة على جانبي انزلاق الغطاء. لتوفير الرطوبة ومنع العينات من الجفاف أثناء الحضانة ، أضف الماء فائق النقاء إلى طبق بتري أصغر ، وضع الطبق بعناية حول زلات الغطاء. ثم قم بتغطية طبق بتري الأكبر حجما واحتضن الخلايا المستزرعة لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة.

بعد الحضانة مع الجسم المضاد الأساسي ، استخدم الملقط للاستفادة بعناية من محلول الأجسام المضادة الأساسي من الغطاء ينزلق على منشفة ورقية ونقل زلات الغطاء إلى صفيحة 24 بئر الأصلية المليئة ب 500 ميكرولتر من PBS. ثم اغسل العينات باستخدام PBS ثلاث مرات لمدة 10 دقائق لكل منها بإثارة لطيفة على شاكر مداري. بعد الغسيل الأخير ، انقل الغطاء مرة أخرى إلى طبق بتري الكبير وأضف 40 ميكرولتر من محلول الأجسام المضادة الثانوي إلى الجزء العلوي من زلة الغطاء.

غطي طبق بتري واحتضني العينات عند 37 درجة مئوية لمدة ساعة واحدة. للربط ، مع الحفاظ على الليغاز على كتلة باردة ، قم بتخفيف الليغاز من 1 إلى 40 باستخدام مخزون الربط وأضف على الفور 40 ميكرولتر من مزيج الليغاز إلى زلات الغطاء. غطي طبق بتري واحتضني العينات عند 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة.

للتضخيم ، قم بتخفيف البوليميراز 1280 على كتلة باردة باستخدام مخزون التضخيم. ثم أضف 40 ميكرولتر من مزيج التضخيم إلى زلات الغطاء واحتضن العينات لمدة 100 دقيقة عند 37 درجة مئوية. بعد ذلك ، للتركيب ، قم بإسقاط ثلاثة ميكرولترات من وسائط التركيب على شريحة.

اضغط على المخزن المؤقت الزائد للغسيل من انزلاق الغطاء وضع الغطاء مع الخلايا التي تتجه لأسفل في وسائط التركيب. أغلق الجانبين بكمية صغيرة من طلاء الأظافر الشفاف لتثبيت الغطاء في مكانه. لتركيب شرائح الأنسجة ، انقل شريحة الأنسجة بعناية إلى الشريحة المعدة وضعها مسطحة.

ثم قم بإسقاط 5 إلى 10 ميكرولترات من الوسائط المتصاعدة على شريحة الأنسجة. ضع غطاء زجاجي مزلقا فوق شريحة الأنسجة وأغلق الغطاء بطلاء أظافر شفاف ، كما هو موضح سابقا. بالنسبة للتصوير الرقمي باستخدام المجهر البؤري ، اضبط الكسب والإزاحة وطاقة الليزر لكل قناة فلورسنت لتقليل ضوضاء الخلفية وتعزيز إشارة الفلورسنت.

تأكد من أن إشارة الفلورسنت ليست مشبعة. بالنسبة للخلايا العصبية المستزرعة ، ضمن علامة التبويب اكتساب ND ، انقر فوق حفظ في ملف. ثم ضمن استعراض، اختر ملفا لحفظ الصورة وإدخال اسم الملف.

بعد ذلك، ضمن علامة التبويب Z، حدد خيار الوضع المتماثل المعرف بواسطة النطاق. اضبط التركيز على أفضل خريطة ذات مستويين وانقر على الزر نسبي لتعيين هذا المستوى البؤري في منتصف المكدس z. بعد ذلك ، اضبط النطاق على خمسة ميكرومترات بخطوات ميكرومتر واحدة وتحقق من إغلاق الغالق النشط أثناء حركة Z.

ضمن علامة التبويب الطول الموجي ، حدد اسم الزر البصري مع إعدادات الاكتساب التي تم تكوينها مسبقا ضمن التكوين البصري وانقر فوق تشغيل الآن. بالنسبة للأنسجة المقطعة، اختر مسح الصورة الكبيرة ضوئيا من قائمة الاكتساب، ثم ضمن لوحة الالتقاط، حدد الزر البصري باستخدام إعدادات الاكتساب التي تم تكوينها مسبقا. أيضا ، حدد الهدف الصحيح في هذه اللوحة.

بعد ذلك ، أسفل لوحة المنطقة وقطعة العين ، استخدم مفاتيح الأسهم لتعيين حدود المنطقة ذات الأهمية أو عائد الاستثمار. ثم انقر فوق حفظ صورة كبيرة في ملف وإنشاء اسم ملف مسار حفظ للصورة. أخيرا ، ضمن لوحة الإعداد ، تأكد من التحقق من الالتقاط متعدد القنوات.

ثم اختر اسم الزر البصري مع إعدادات الاكتساب التي تم تكوينها مسبقا ضمن التكوين البصري. في ImageJ ، افتح خيار العتبة بالانتقال إلى قائمة الصورة ، والنقر فوق ضبط ، ثم العتبة. اختر خيار الخلفية الداكنة إذا كانت الصورة تحتوي على خلفية داكنة.

بعد ذلك ، اضبط الحدود العليا والسفلية للعتبة لكل إعدادات عتبة محسنة تم تحديدها مسبقا وانقر فوق تطبيق. بالنسبة للخلايا المستزرعة ، استخدم قناة MAP2 وأداة عائد استثمار يدوي حر لرسم عائد استثمار لكل خلية عصبية ، بما في ذلك التشعبات و soma. بالنسبة للأنسجة المقطعة، ارسم عائد استثمار حر داخل صورة الشريحة التي تغلف منطقة الاهتمام.

ثم احصل على مساحة عائد الاستثمار عن طريق فتح قائمة التحليل والنقر فوق قياس. للكشف عن عدد البونتا داخل كل عائد استثمار ، استخدم أداة اكتشاف تلقائية مثل تحليل الجسيمات. من القائمة تحليل، حدد الجسيمات التي تم تحليلها وحدد قطر حجم الثقب.

بعد ذلك ، من القائمة المنسدلة إظهار ، اختر خيار أقنعة التراكب ، ثم حدد خيار عرض النتائج وانقر فوق موافق. لتقسيم عدد البونتا على مساحة عائد الاستثمار الفردي، انسخ النتائج لكل صورة والصقها من النتائج المنبثقة في جدول بيانات. حدد الملف وقم بأخذ عينة من البيانات التي تم الحصول عليها منا ، وقسم مساحة عائد الاستثمار على عدد punta.

وأخيرا، لتطبيع النتائج للسيطرة على العينات، متوسط النتائج لعينات التحكم وقسمة النتائج التي تم الحصول عليها من جميع العينات على متوسط الضابط. ناهض GABAB ، باكلوفين ، مطلوب لفعالية في المختبر لمضادات الاكتئاب السريعة Ro-256981. تظهر الزيادة في تكوين المشبك من خلال زيادة في بونتا البيضاء.

بدون باكلوفين ، لا تظهر أي زيادة في تكوين المشبك. في الجسم الحي ، يؤدي الحقن داخل الصفاق لمضادات الاكتئاب السريعة إلى زيادة في تكوين المشبك مقارنة بالتحكم الملحي. في حين أن بعض البونتا تظهر في صور التحكم الفني ، إلا أنها ليست عموما بنفس الحجم كما هو موضح في المواصفات البيضاء مقارنة بالبونتا الكبيرة في اللوحات الأخرى.

علاوة على ذلك ، فإن هذه البونتا ليست في نفس الموقع كما يتضح من بعض البونتا التي تظهر داخل السوما. يمكن ل DetectSyn تحديد التغييرات التي تطرأ على نقاط الاشتباك العصبي بسبب حالة مرضية أو علاج دوائي. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في توفير نظرة ثاقبة لأي مجال من مجالات البحث التي تدرس الاضطرابات التي تؤثر على تطور أو انهيار نقاط الاشتباك العصبي.