التحليل الطيفي للقرص المضغوط لدراسة التفاعلات بين الحمض النووي والبروتين

يسمح لنا البروتوكول بتصور التغييرات في إعادة الهيكلة الثانية للحمض النووي الناجم عن بروتينات الكروماتين المعتمدة على ATP. يمكن ربط التغيير في بنية الحمض النووي بتنظيم النسخ. هذه تقنية سهلة وحساسة للغاية تستخدم كمية صغيرة جدا من الحمض النووي النقي لتسجيل التغيرات الهيكلية في أوليغونوكليوتيد.

يمكن أن توفر هذه الطريقة نظرة ثاقبة في تنظيم النسخ بوساطة الكروماتين المعتمد على ATP إعادة عرض البروتينات. للبدء، وإعداد تركيزات العمل من المخازن المؤقتة وغيرها من مكونات التفاعل الطازجة والاحتفاظ بها في أربع درجات مئوية قبل إعداد ردود الفعل، ثم قياس نشاط ATPase من البروتين في وجود جزيئات الحمض النووي المختلفة باستخدام NADH مقرونة فحص الأكسدة. مزيج 0.1 ملليمولار ADAAD، اثنين من ATP ملليمولار، 10 نانومولار الحمض النووي، و1X REG العازلة في لوحة 96 جيدا إلى حجم النهائي من 250 ميكرولتر.

بعد ذلك ، احتضن التفاعل لمدة 30 دقيقة في حاضنة 37 درجة مئوية ، ثم قم بقياس كمية NAD + باستخدام البرنامج المقدم مع قارئ اللوحة الدقيقة. لقياس الامتصاص عند 340 نانومتر، انقر على المقايسة NADH وضع لوحة 96 جيدا على حامل لوحة في الصك، ثم انقر على زر لوحة القراءة لتسجيل الامتصاص. جمع أطياف القرص المضغوط في cuvettes كوارتز عالية الشفافية.

استخدام إما مستطيلة أو أسطوانية cuvettes. لتنظيف cuvettes، وغسلها بالماء عدة مرات، ثم أخذ مسح للمياه أو العازلة في cuvette للتحقق ما إذا كان نظيفا. لردود الفعل، استخدم حمض نووي منقي PAGE أوليغونوكليوتيدات.

لالتبريد السريع، سخني الحمض النووي عند 94 درجة مئوية لمدة ثلاث دقائق على كتلة التدفئة وبرده على الفور على الجليد. لتبريد بطيء، بعد تسخين الحمض النووي في 94 درجة مئوية لمدة ثلاث دقائق، والسماح لها لتبرد لدرجة حرارة الغرفة بمعدل درجة مئوية واحدة في الدقيقة الواحدة. لتسجيل أطياف خط الأساس، قم بإعداد ما مجموعه خمسة تفاعلات تحكم واحدة تلو الأخرى في أنابيب الطرد المركزي 1.5 ملليلتر.

الحفاظ على حجم رد الفعل في 300 ميكرولتر في جميع ردود الفعل. لتسجيل أطياف القرص المضغوط، قم بإعداد ما مجموعه خمسة ردود فعل تجريبية واحدا تلو الآخر في أنابيب الطرد المركزي 1.5 ملليلتر. لتسجيل المسح الضوئي، قم بتشغيل الغاز وتشغيل مطياف القرص المضغوط.

بعد 10 إلى 15 دقيقة، قم بتشغيل المصباح، قم بتشغيل حمام الماء وحدد درجة حرارة الحامل عند 37 درجة مئوية. بعد ذلك ، افتح برنامج طيف القرص المضغوط وحدد درجة الحرارة إلى 37 درجة مئوية ، ونطاق الطول الموجي عند 180 إلى 300 نانومتر ، والوقت لكل نقطة إلى 0.5 ثانية ، ورقم المسح الضوئي إلى خمسة ، ثم انقر على عارض البيانات المحترف ، وجعل ملف جديد ، وإعادة تسميته بتفاصيل التجربة والتاريخ. بعد ذلك ، اخلط ردود الفعل الأساسية والتجريبية عن طريق الأنابيب ونقل التفاعل بعناية واحدة تلو الآخر إلى cuvette ، مما يضمن عدم وجود فقاعات هوائية.

إذا كان أداء تجربة دورة زمنية، واحتضان ردود الفعل في 37 درجة مئوية للوقت المطلوب، ثم أخذ المسح الضوئي. إضافة EDTA إلى المخزن المؤقت الذي يحتوي على الحمض النووي، ATP، المغنيسيوم، والبروتين لوقف التحلل المائي ATP. لمنع نشاط ATPase تماما، قم بزيادة تركيز EDTA ووقت الحضانة.

طرح خطوط الأساس من ردود الفعل المقابلة في البرنامج وتنعيم البيانات إما في برنامج الطيف CD أو في برنامج رسم البيانات، ثم رسم رسم بياني للطول الموجي ضد الناقصة بقايا متوسط وتحليل القمم. M-طيات أظهرت أن كلا فروع الحمض النووي MYC يمكن أن تشكل بنية الجذعية حلقة مثل. تظهر هنا هياكل M-fold للأمام وتسلسل الحمض النووي العكسي الذي يحتوي على G quadruplex GECE.

وأظهرت أطياف القرص المضغوط من GECE تبريد سريع في غياب ووجود ATP وADAAD أن ADAAD يحفز اثنين من القمم الإيجابية، واحدة في 258 نانومتر والآخر في 210 نانومتر. إضافة EDTA يلغي هذا التغيير التوافقي. أطياف القرص المضغوط لديها الآن ذروة سلبية 210 نانومتر وفرقة إيجابية واسعة مع قمم في 230 و 250 نانومتر.

وأظهر تحليل مخطط QGRS وتحليل M-fold أن المناطق المروجة ل DROSHA و DGCR8 و DICER تمتلك القدرة على تشكيل رباعيات G وهياكل تشبه الجذع. وأظهرت أطياف القرص المضغوط للزوج DROSHA خمسة أن ADAAD يحفز ذروة سلبية في 210 نانومتر وذروة إيجابية في 260 نانومتر. هذا الطيف هو سمة من سمات ADNA.

وأظهرت أطياف القرص المضغوط للزوج DGCR8 واحد ذروة إيجابية في 210 نانومتر وذروة سلبية واسعة في 260 نانومتر. هذا الطيف هو سمة من سمات الانتقال من B إلى X. بالنسبة للزوج DGCR8 سبعة ، شوهدت قمم إيجابية قوية في 210 و 270 نانومتر وذروة سلبية عند 250 نانومتر.

هذا الطيف هو سمة من سمات مواز G رباعية هياكل الحمض النووي. وأخيرا، بالنسبة للزوج DICER واحد، لوحظت ذروة إيجابية في 210 نانومتر وقممتين سلبيتين، واحدة في 230 نانومتر والأخرى في 260 نانومتر. هذه القمم هي سمة من سمات انتقال الحمض النووي من A إلى X.

تأكد من أن نقاء الحمض النووي والبروتين هو 99٪ أو أكثر. يجب أن يكون cuvette نظيفا ويجب أن يكون خط الأساس أقل من ميليدغري واحد. يجب أن تكون جميع الكواشف نقية بحيث تكون الخلفية أقل من ميليدغري واحد.