استهداف الصفائح العصبية الفئرانية بواسطة حقن النانو في الرحم (NEPTUNE) في اليوم الجنيني 7.5
February 14th, 2022
في هذا البروتوكول ، نصف كيفية حقن التجويف الأمنيوسي للفأر عند E7.5 مع lentivirus ، مما يؤدي إلى نقل موحد للصفيحة العصبية بأكملها ، مع الحد الأدنى من الآثار الضارة على البقاء على قيد الحياة أو التطور الجنيني.
يسمح NEPTUNE بالاستهداف والتلاعب الجيني للجهاز العصبي الجنيني للفأر من اليوم الجنيني 7.5 ويتيح توليد نماذج الضربة القاضية أو تتبع النسب في أيام. هذا البروتوكول قابل للتكيف ومرن وسريع. يمكننا تقديم shRNA أو cdRNA أو مكتبات فيروسية مشفرة لمعالجة أسئلة مختلفة في أيام بدلا من أشهر أو سنوات.
نتوقع أن يوفر NEPTUNE رؤى في علم الأعصاب ولكن يمكن أيضا تكييفه مع أنظمة الأعضاء الأخرى. يمكن أن يكون تحديد التجويف الأمنيوسي أمرا صعبا للغاية ، لذا خذ وقتك للنظر في صورة الموجات فوق الصوتية وربما يكون لديك كتاب مدرسي أو مورد تشريح آخر في متناول اليد. لبدء تحميل الإبرة ، حرك الإبرة الزجاجية على المكبس المعدني ، مع الحفاظ على كوليت متصلا ولكن مخففا قليلا.
ثم ، ادفع الإبرة الشعرية مع المكبس المعدني عبر الحشية الأمامية حتى تصل إلى الفاصل. اضغط على Empty (فارغ) لدفع المكبس إلى داخل الإبرة وطرد الزيت من طرف الإبرة. ثم اضغط على تعبئة لإنشاء فقاعة هواء، تقسم الزيت والمحلول.
أخيرا ، اخفض الإبرة ، واغمر الطرف في المحلول ، واضغط على Fill مرة أخرى لتحميل الإبرة. بعد تثبيت أنثى فأرة مخدرة مع تجاويف أمنيوسية مثالية الحجم على طاولة التسخين ، ضع جل العين على كلتا العينين لمنع جفاف القرنية وحقن مسكن للألم تحت الجلد. ثم ، قم بتعقيم أسفل البطن عن طريق المسح بقطعة قماش منقوعة ب 0.5 ملليغرام لكل محلول كلورهيكسيدين ملليلتر وجفف الجلد.
بعد ذلك ، باستخدام مقص جراحي ، قم بعمل شق جلدي عمودي في خط الوسط بطول 1.5 إلى 2 سم في أسفل البطن. ثم ارفع الجلد بلطف وحرره من طبقة العضلات الأساسية حوالي سنتيمتر واحد حول نقطة الشق لتسهيل الخياطة بعد الجراحة. بعد ذلك ، قم بعمل شق عمودي في خط الوسط يبلغ طوله سنتيمترا واحدا في طبقة العضلات.
باستخدام زوج واحد من الملقط ، ارفع جانبا واحدا من الجلد وطبقة العضلات ، ومع زوج آخر ، ابحث عن قرون الرحم. ثم ، باستخدام الملقط ، أمسك الأنسجة بين الأجنة واسحب بعناية كل من قرون الرحم من البطن. عد الأجنة وعددها ، إما من المبيض إلى عنق الرحم أو من عنق الرحم إلى المبيض ، على كلا الجانبين.
بعد ذلك ، باستخدام قطعة قطن رطبة ، ادفع جميع الأجنة بلطف إلى تجويف البطن ، باستثناء الثلاثة الأولى التي يتم حقنها. ثم ضع قطرة من PBS على غشاء مرن ملتصق بالفتحة المركزية المستديرة لطبق بتري معدل متاح تجاريا وأمسكه مباشرة فوق الأجنة. أدخل ملقطا مغلقا في شق المرونة ، ثم حرر الملقط لفتح الشق المرن ، وأسقط السائل على الأجنة.
باستخدام الملقط ، اسحب قسم الرحم المقابل للأجنة الثلاثة من خلال المرونة وجثم طبق بتري بلطف على بطن الفأر. باستخدام أربعة أقدام طينية ، قم بتأمين وربط طبق بتري فوق البطن لتقليل الضغط على الماوس ، وكذلك تقليل حساسية التصوير لتنفس الفأر وضربات قلبه. بعد ذلك ، باستخدام ملقط وقطعة قطن رطبة ، اضبط الرحم والمرونة لضمان إغلاق المرونة حول جلد الماوس ، مما يمنع تسرب PBS.
بعد ذلك ، لتثبيت الرحم ، اضغط على أسطوانة الطين النمذجة لأسفل على يمين الأجنة أو الرحم وأضف PBS إلى طبق Petri حتى يتم تغطية الأجنة والرحم بالكامل ب PBS. لتسهيل تسجيل الحقن ، اغمس مسبار الموجات فوق الصوتية في PBS واضبط الماوس أو الجدول الجراحي بحيث يتم محاذاة الجنين الأول مع مسبار الموجات فوق الصوتية. افحص الأجنة الثلاثة وافحص التجاويف الأمنيوسية.
ثم ، باستخدام جهاز الموجات فوق الصوتية ، قم بقياس قطر التجويف الأمنيوسي لتحديد حجم الحقن المناسب. باستخدام وحدة التحكم في الحقن ، اضبط أحجام الحقن المحددة وسرعة الحقن على التباطؤ ، بمعدل حقن يبلغ 23 نانولتر في الثانية. بعد خفض الإبرة في PBS ، باستخدام العجلات الرئيسية على نظام السكك الحديدية ، اضغط على Empty (فارغ) على وحدة التحكم في حاقن النانو حتى يصل السائل إلى طرف الإبرة.
ثم ارفع الإبرة من PBS واضغط على حقن للتحقق من تفريغ قطرة من الحجم المطلوب التقريبي. اخفض الإبرة إلى PBS مرة أخرى وحرك الحاقن النانوي باستخدام عجلة المستوى Y على المتلاعب الدقيق لمحاذاة الإبرة مع مسبار الموجات فوق الصوتية والجنين. اضبط زاوية الإبرة باستخدام عجلة زاوية الحقن لضمان زاوية حقن شبه عمودية بالنسبة لجدار الرحم.
ثم ، باستخدام عجلة الحقن على المتلاعب الدقيق ، أدخل الإبرة في التجويف الأمنيوسي في حركة واحدة. إذا اختفى طرف الإبرة من صورة الموجات فوق الصوتية، فحرك المسبار إلى الأمام أو الخلف لإعادة الإبرة إلى التركيز البؤري. ثم قم بحقن الحجم المطلوب عن طريق الضغط على حقن لعدد مناسب من المرات.
بعد حقن الحجم المطلوب ، انتظر لمدة 5 إلى 10 ثوان قبل سحب الإبرة في حركة واحدة لطيفة. انقل المرحلة إلى الجنين التالي وكرر الحقن للجنينين الآخرين كما هو موضح. بعد ذلك ، ارفع مسبار الموجات فوق الصوتية والإبرة من PBS باستخدام المتلاعب الدقيق ، مع تحويل الإبرة بعيدا عن المشغل لتجنب التلف والإصابة.
باستخدام الملقط ، ضع الجنينين الأول والثاني مرة أخرى في البطن عن طريق دفعهما بلطف عبر المرن. ثم، أمسك بلطف الأنسجة المجاورة للجنين الثالث واسحب الرحم نحو الطرف العلوي من الشق المرن. اسحب بلطف الأجنة الرابعة إلى السادسة باستخدام ملقط واسمح للجنين الثالث بالعودة إلى البطن.
بعد حقن جميع الأجنة ذات التجاويف الأمنيوسية المثلى ، ادفع الأجنة والرحم بلطف إلى بطن الفأر. يؤدي النقل الناجح للصفيحة العصبية إلى أجنة ذات تعبير قوي عن مراسل الفلورسنت في الدماغ والأنسجة الأخرى المشتقة من الأديم الخارجي ، مثل الجلد. قد يؤدي حقن كميات كبيرة بشكل مفرط إلى عيوب في الأنبوب العصبي، مثل التهاب الدماغ.
تؤدي الحقن الناجحة في اليوم الجنيني 7.5 إلى نقل موحد من الدماغ الأمامي إلى الدماغ الخلفي ، بما في ذلك الضفيرة المشيمية . تؤدي حقن العيار المنخفض إلى نقل الحيوانات المستنسخة أحادية الخلية ، في حين أن فيروس العيار العالي ينقل ما يقرب من 100٪ من الدماغ بأكمله. أظهرت المقاطع الإكليلية خلال اليوم الجنيني 13.5 جنينا انتقالا عاليا وموحدا للأنسجة العصبية للعين والعدسة والقرنية واللحمة المتوسطة.
بعد الحقن في اليوم الجنيني 9.5 ، تتطور الغدد والقنوات اللعابية حول اليوم الجنيني 11.5 من الظهارة الفموية. يتم نقل الظهارة اللسانية للسان بشكل جيد ، في حين أن اللحمة المتوسطة الكامنة سالبة. بالإضافة إلى ذلك ، يتم فصل المجموعات الإيجابية داخل الظهارة اللسانية بواسطة أقسام سالبة ، مما يشير إلى نقل سطح الحليم.
تؤدي الحقن في اليوم الجنيني 7.5 إلى نقل واسع النطاق للحمة المتوسطة للسان في اليوم الجنيني 13.5 ، مما يشير إلى أن الحقن المبكرة تستهدف خلايا القمة العصبية ، مما يساهم في اللحمة المتوسطة في اللسان. تؤدي الحقن الفيروسية اللسعية أيضا إلى استهداف واسع النطاق للجهاز العصبي المركزي والمحيطي ، مما يؤدي إلى نقل كل من الخلايا العصبية والأسلاف في الحبل الشوكي ، وكذلك العقد الجذرية الظهرية. الإعداد الجيد ضروري.
تأكد من عدم وجود تسرب وأن الأجنة ثابتة بشكل جيد ، بحيث يمكنك التركيز بالكامل على الحقن في تجويف الفئران. بعد نبتون ، يمكن إجراء التحليل بطرق مختلفة ، مثل تحليل الفلورسنت المناعي للدماغ ، أو تسلسل الحمض النووي الريبي أحادي الخلية ، أو السماح للأجنة المحقونة بالولادة للتحليل السلوكي.
نظرة عامة
يحدد هذا البروتوكول طريقة حقن فيروس اللينتيفيروس في تجويف السلى الخاص بالفأر في اليوم الجنيني 7.5، مما يسهل التوصيل المتجانس للوحة العصبية مع الحد الأدنى من التأثيرات السلبية على تطور الجنين.
مكونات الدراسة الرئيسية
مجال العلم
- علم الأعصاب
- علم الأحياء التنموي
- التلاعب الجيني
الخلفية
- يُمكّن NEPTUNE التلاعب الجيني في الجهاز العصبي الجنيني للفأر.
- يسمح بجيل سريع لنماذج تقليل التعبير أو تتبع الأنساب.
- البروتكول قابل للتكيف مع مختلف الاحتياجات التجريبية.
- يمكن أن يكون تحديد تجويف السلى تحديًا ويتطلب تصويرًا دقيقًا بالموجات فوق الصوتية.
هدف الدراسة
- توفير طريقة لتوصيل فيروسي فعال إلى اللوحة العصبية.
- تعزيز فهم تطور الجهاز العصبي الجنيني.
- تسهيل الجداول الزمنية التجريبية السريعة في الدراسات الوراثية.
الطرق المستخدمة
- حقن فيروس اللينتيفيروس في تجويف السلى لجنين الفأر.
- استخدام الموجات فوق الصوتية للإرشاد أثناء الحقن.
- تحضير موقع الجراحة والجنين للحقن.
- مراقبة تطور الجنين بعد الحقن.
النتائج الرئيسية
- تمت ملاحظة توصيل ناجح للوحة العصبية.
- تعبير قوي للمراسلات الفلورية في الدماغ والأنسجة المشتقة من الخارج.
- تأثيرات ضارّة قليلة على بقاء الجنين وتطوره.
- احتمال حدوث عيوب في الأنبوب العصبي مع كميات حقن مفرطة.
الاستنتاجات
- بروتوكول NEPTUNE فعال للتلاعب الجيني في الأجنة المبكرة للفأر.
- يوفر نهجًا سريعًا لدراسة التطور الجنيني.
- قد تمتد التطبيقات الأخرى إلى أنظمة الأعضاء الأخرى.
الأسئلة المتداولة
Executive Industry Relevance
NEPTUNE enables early-stage genetic manipulation of the mouse neural plate at E7.5, providing a rapid, scalable approach for target validation and functional genomics in neuroscience. By achieving >95% transduction of neural plate and neural crest derivatives, the method supports mechanistic de-risking of therapeutic hypotheses in prenatal neurodevelopment. This reduces animal usage and accelerates lead identification pipelines for CNS-targeted therapeutics.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of gene function in neural plate-derived tissues including brain, spinal cord, and peripheral nervous system.
- Operational Value: Supports rapid generation of knockdown or lineage tracing models in days rather than months.
- Strategic Value: Facilitates target confidence through uniform transduction of >95% of developing brain with high-titer lentivirus.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Allows mosaic transduction with low-titer virus for genetic screening and clonal analysis.
- Operational Value: Enables preparation of validated biological systems for downstream assays like immunofluorescent imaging and scRNA-seq.
- Strategic Value: Enhances screening readiness by providing quantitative, reproducible transduction metrics.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Targets ectoderm and neural crest contributing to eye, tongue, and PNS, enabling disease-relevant system modeling.
- Operational Value: Provides continuity from preneurulation stages through embryonic day 13.5 analysis.
- Strategic Value: Supports predictive de-risking by linking early genetic manipulation to phenotypic outcomes in neural and peripheral tissues.
Pipeline & Workflow Integration
NEPTUNE fits within the discovery continuum from target hypothesis testing to lead identification, enabling early functional validation of genes in neurodevelopmental pathways.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification via inducible shRNA or cDNA delivery to neural plate.
- Screening: Enables assay-ready models with uniform or mosaic transduction for compound or genetic library screening.
- Analytics: Generates quantitative readouts such as fluorescent reporter expression and scRNA-seq data for condition comparison.
- Translational Research: Connects to preclinical validation through transduction of neural crest-derived tissues like dorsal root ganglia and tongue mesenchyme.
- Enterprise Reuse: Adaptable platform for delivering shRNA, cDNA, or barcoded libraries across organ systems beyond neuroscience.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence in target validation through early, widespread neural plate transduction.
- Operational Value: Standardized, reproducible injection protocol guided by ultrasound imaging.
- Strategic Value: Reduced late-stage biological risk via early mechanistic de-risking in embryogenesis.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of targets based on prenatal phenotypic consequences.
Implementation Considerations
- Requires expertise in mouse embryology, ultrasound guidance, and microsurgical techniques.
- Dependent on nanoinjector systems, glass capillary preparation, and sterile surgical setup.
- Necessitates cross-team standardization for embryo staging, injection volume calibration, and postoperative care.
- Adaptation across model systems requires validation of amniotic cavity access and viral tropism.
- Practical limitations include sensitivity to injection volume, with excessive volumes risking neural tube defects like exencephaly.
