التشريح المجهري وتفكك قناة المبيض المورينية: تحديد الجزء الفردي وعزل الخلية الواحدة
نوفمبر 4, 2021
يتم تقديم طريقة للتشريح المجهري لقناة بيض الفأر تسمح بجمع الأجزاء الفردية مع الحفاظ على سلامة الحمض النووي الريبي. بالإضافة إلى ذلك ، يتم وصف إجراء تفكك الخلايا البيضوية غير الأنزيمية. الطرق مناسبة لتحليل الجينات والبروتين اللاحق للقطاعات البيضية المختلفة وظيفيا والخلايا البيضوية المنفصلة.
شرائح قناة البيض المختلفة لها وظائف فسيولوجية متميزة وهي عرضة بشكل تفاضلي للتغير المرضي. يعد تحديد الأجزاء المختلفة في قناة بيض فأر صغيرة جدا أمرا صعبا ، وكذلك إنتاج عائد جيد من الخلايا المتمايزة جيدا عن طريق تفكك الأنسجة. في هذا الفيديو ، سنوضح كيفية فك قناة بيض الفأر ، والتعرف على الأجزاء المختلفة بحيث يمكن تحليلها بشكل فردي ، وأخيرا ، كيفية إنتاج غلة عالية نسبيا من الخلايا المنفصلة المتباينة.
قد يؤدي الفهم الأفضل للبيئة الخاصة بالأمبولا إلى تحسين تقنيات الإخصاب في المختبر. أيضا ، من خلال مقارنة infundibulum مع شرائح أخرى ، قد نفهم بشكل أفضل ميل infundibulum للتحول الخبيث. يقوم إجراء التفكك أحادي الخلية بتحرير الخلايا اللحمية والظهارية من قناة البيض.
توفر طريقتنا أيضا فرصا لتحليل مساهمات الخلايا المناعية والعضلات الملساء والخلايا الظهارية بشكل منفصل في علم وظائف الأعضاء وعلم الأمراض في قناة البيض. قد يكون العمل تحت مجهر التشريح صعبا في البداية. أنصح بالتدرب على أنبوب أكبر مثل الرحم للتأكد من أن أدواتك كافية للتسلخ المجهري لقناة البيض.
ابدأ بلصق قطعة من شمع الأسنان على طبق بتري بمادة لاصقة واتركها تجف. ثم قم بتعقيم الطبق بنسبة 70٪ من الإيثانول. السطح جاهز الآن للتشريح.
شل حركة طبق بتري الذي يحتوي على شمع الأسنان على المنصة الباردة تحت مجهر تشريح عندما يكون جاهزا للتشريح. تطهير السطح البطني للحيوان بنسبة 70٪ من الإيثانول. ثم افتح تجويف البطن والحوض بمقص تشريح معقم.
حرك الجهاز الهضمي إلى جانب واحد لتحديد موقع الرحم الظهري ثنائي القرن. اتبع كل قرن رحمي على السطح لتحديد موقع كل قناة بيض ومبيض مغلفة في وسادة الدهون الرحمية أسفل الكلى مباشرة. ثم قم باستئصال كل من قنوات البيض الجانبية مع المبيضين وجزء من قرن الرحم البعيد الذي لا يزال متصلا باستخدام مقص التشريح.
قطع كل قرن رحمي جانبي مع ما يقرب من واحد إلى اثنين سنتيمترات من القرن لا يزال متصلا بقناة البيض الملفوفة والمبيض. غمر الأنسجة على الفور في ملليلتر من وسط التشريح البارد ، ثم قم بلصق أنسجة الرحم على شمع الأسنان بإبرة قياس 25 معقمة لتأمين الأنسجة للتشريح. تنظيف وتشريح وسادة الدهون المبيض والنسيج الضام لتصور قناة البيض بوضوح.
استخدم حقنة ملليلتر واحدة لتوزيع قطرة إلى قطرتين من محلول صبغة التولويدين الأزرق المعقم بنسبة 1٪ واحتضانه لمدة 30 ثانية إلى دقيقة واحدة. شطف مع DPBS الباردة ثم إزالة كل السائل. اسحب المبيض برفق من قناة البيض الملفوفة.
قطع في الغشاء الجراب في الرباط العريض لإزالة المبيض من قناة البيض دون المساس بالأنسجة البوقية. حدد موقع الطرف الفيمبري البعيد لقناة البيض الموجودة جانبيا لتقاطع البوق الرحمي. اسحب الأنبوب بلطف واقطعه بعيدا عند الميزوسالبينكس باستخدام مقص صغير زنبركي لفك قناة البيض.
قطع الأنبوب لإنتاج المنطقة القاعية. ثم قم باستئصال المنطقة الأمبولية عن طريق القطع بين الدورتين الثانية والثالثة. أخيرا ، قم بقطع الجزء المتبقي إلى تقاطع أنبوب الرحم وهو منطقة البرزخ.
قم على الفور بتجميد أجزاء الأنسجة المشوهة في النيتروجين السائل ثم أضف 200 ميكرولتر من كاشف استخراج الحمض النووي الريبي البارد ومزيج خرزة التجانس الفردي إلى الأنسجة لعزل الحمض النووي الريبي. بدءا من منطقة فيمبرال ، شق الأنبوب طوليا باستخدام مقص زنبركي الشكل واستخدم الملقط كوسيلة ضغط لفضح الظهارة المضيئة. افرم الأجزاء المفتوحة من الشق وقناة البيض المتبقية إلى ما يقرب من جزء واحد إلى مليمترين.
ثم أضف خمسة ملليلترات من العازلة الدافئة غير الأنزيمية إلى الأنسجة واحتضنها عند 37 درجة مئوية. تظهر هنا صور تباين الفلورسنت والطور لعنقود خلوي إيجابي للأوكلودين والنوى والتوبولين الأسيتيلات. الأحمر يدل على أوكلودين ، والأزرق يدل على النوى ، والأخضر يدل على توبولين أسيتيلات.
تبقى الحدود القمية الهدبية سليمة طوال البروتوكول وتقاوم المزيد من الهضم للخلايا المفردة. في هذه الصور التمثيلية ، يتم عرض القنوات المدمجة والحمراء والزرقاء وتباين الطور والخضراء. بعد حضانة pronase قصيرة ، تكون غالبية الخلايا مفردة.
يظهر تلطيخ يوديد البروبيديوم قابلية البقاء بنسبة 93٪ تقريبا في Brightfield ، وإيجابية PI للقناة الحمراء ، والدمج. يظهر التضمين عند الدمج حدا هدبيا سليما على خلية واحدة منفصلة. هذه الخلايا لديها بنشاط ضرب الأهداب.
تم تقييم الحمض النووي الريبي الكامل من حيث الإنتاجية والجودة بواسطة مقياس الطيف الضوئي صغير الحجم والمحلل الحيوي. تظهر النتائج أن هذه الطريقة تنتج 800 إلى 1،200 نانوغرام من الحمض النووي الريبي لكل جزء باستثناء العينات غير القاعية حيث قد يكون التجمع من حيوانين ضروريا للحصول على عائد مناسب للفحوصات النهائية. يتم تجميع النتائج المقدمة ل infundibulum من حيوانين ، يبلغ مجموعهما أربع مناطق غير قابلة للتمويل.
يحقق هذا البروتوكول بنجاح الحمض النووي الريبي النقي الذي تم تحليله باستخدام مقياس الطيف الضوئي صغير الحجم ومحلل حيوي. تحتوي العينات على نسبة امتصاص 260 × 280 نانومتر بين 1.8 و 2 ، وهي نموذجية لأنواع نيوكليوتيدات الحمض النووي الريبي النقية. أظهر التحليل الحيوي للعينات سلامة عالية للحمض النووي الريبي مع تقييم رقم سلامة الحمض النووي الريبي فوق سبعة ، وهو مناسب للتعبير عن المصب وتحليل التسلسل.
تذكر الاحتفاظ بواحد إلى سنتيمترين من قرن الرحم لتثبيت نظام البوق على منصة التشريح. بالإضافة إلى ذلك ، يساعد استخدام صبغة تولويدين الزرقاء في فك اللفائف السريع لقناة البيض. كلما كان فك اللفائف أسرع ، كان الحفظ أفضل وأقل قدر من تحلل الحمض النووي الريبي.
هذه الطريقة كافية للحصول على الحمض النووي الريبي بجودة مناسبة لتسلسل الحمض النووي الريبي مما يسمح بتسلسل المقطع الفردي. يعد تفكك الخلية مناسبا لتسلسل الخلية الواحدة أو قياس التدفق الخلوي مما يسمح بتحليل أكثر دقة للجزء والخلية. ستساعد هذه الطريقة في نقل الحقل إلى ما وراء تحليل الأنبوب بأكمله الذي يخفي الاختلافات على مستوى الشريحة أو الخلية الواحدة.
اعرض النص الكامل واحصل على الوصول إلى آلاف الفيديوهات العلمية
نظرة عامة
تقدم هذه المقالة طريقة لتشريح دقيق لقناة فالوب في الفأر، مما يتيح جمع الأجزاء الفردية مع الحفاظ على سلامة الحمض النووي الريبي. كما تصف إجراءً غير إنزيمي لفصل الخلايا في قناة فالوب، مناسب لتحليل الجينات والبروتينات.
مكونات الدراسة الرئيسية
مجال العلم
- علم الأعصاب
- بيولوجيا الخلية
- بيولوجيا التكاثر
الخلفية
- تمتلك أجزاء مختلفة من قناة فالوب وظائف فسيولوجية فريدة.
- تختلف هذه الأجزاء في قابليتها للتغيرات المرضية.
- يعتبر تحديد الأجزاء في قنوات فالوب الصغيرة للفئران تحديًا.
- يصعب إنتاج خلايا متمايزة بشكل جيد من خلال تفكيك الأنسجة.
هدف الدراسة
- لإظهار فتح قناة فالوب للفأر.
- لتحديد وتحليل أجزاء مختلفة من قناة فالوب بشكل فردي.
- لتعزيز فهم بيئة الأمبولة لتحسين تقنيات الإخصاب في المختبر.
الطرق المستخدمة
- تشريح دقيق لقناة فالوب للفأر.
- تحديد أجزاء قناة فالوب المميزة.
- فصل غير إنزيمي لخلايا قناة فالوب.
- تحليل الخلايا اللحمية والظهارية.
النتائج الرئيسية
- التحديد الناجح للأجزاء الفردية من قناة فالوب.
- حصول على عائد عالٍ من الخلايا المنفصلة المتمايزة.
- رؤى حول دور الجيب في التحول الخبيث.
- تحسينات محتملة في تقنيات الإخصاب في المختبر.
الاستنتاجات
- تسهل الطرق المقدمة تحليلًا مفصلًا لأجزاء قناة فالوب.
- يمكن أن يؤدي فهم وظائف الأجزاء المحددة إلى تعزيز البحث في مجال التكاثر.
- قد تركز الدراسات المستقبلية على الآثار المترتبة على علاجات الخصوبة.
الأسئلة الشائعة
Executive Industry Relevance
This method enables precise molecular and cellular analysis of the murine oviduct by overcoming technical barriers posed by its small size and complex anatomy. It supports target validation and mechanistic de-risking in reproductive biology, oncology, and immunology by allowing segment-specific interrogation of physiological and pathological processes. The approach enhances predictive confidence in preclinical models by preserving RNA integrity and yielding viable, differentiated single cells for downstream applications such as RT-qPCR, RNAseq, and flow cytometry.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of segment-specific physiological functions and differential susceptibility to pathological changes such as malignant transformation in the infundibulum.
- Operational Value: Provides pure RNA yields of 800–1,200 ng per segment, sufficient for RT-qPCR and RNAseq, supporting reliable target validation workflows.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Facilitates preparation of validated biological systems for downstream assays by isolating fully differentiated oviductal cells with intact ciliated borders and high viability (approximately 93%).
- Operational Value: Uses a mostly non-enzymatic dissociation buffer that preserves cell integrity, enabling reproducible single-cell isolation for flow cytometry and single-cell RNAseq.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Supports disease-relevant system analysis by enabling separate evaluation of immune, smooth muscle, and epithelial cell contributions to oviduct physiology and pathology.
- Operational Value: Ensures continuity from discovery through preclinical validation by providing segment-resolved molecular and cellular data aligned with embryological origins and epithelial cell type ratios.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into the discovery continuum from early biology to lead identification by enabling hypothesis testing at the oviduct segment level and supporting mechanistic de-risking through precise biological system preparation.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by allowing individual analysis of the four functional oviduct segments with distinct epithelial cell type ratios.
- Screening: Enables assay readiness through standardized dissociation that yields viable, differentiated cells suitable for quantitative analysis in screening platforms.
- Analytics: Delivers high-integrity RNA (RIN >7) and quantifiable single-cell outputs that allow comparison of conditions across segments and cell types.
- Translational Research: Connects to preclinical continuity by enabling analysis of segment-specific disease susceptibility, such as infundibulum-derived precursor lesions to serous intraepithelial carcinomas.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable capability for oviduct research across reproduction, fertility, cancer, and immunology programs, reducing reliance on whole-tube analysis that masks segment-level differences.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence through segment-specific target validation and reduction of mechanistic ambiguity in complex tissue systems.
- Operational Value: Standardization, reproducibility, and scalability via a defined microdissection and dissociation protocol that minimizes RNA degradation.
- Strategic Value: Better go/no-go decisions, capital efficiency, and reduced late-stage biological risk by enabling early detection of segment-specific pathological susceptibilities.
- Portfolio Impact: Risk-adjusted prioritization and advancement decisions based on mechanistic insights from individual oviduct segments and cell populations.
Implementation Considerations
- Requires expertise in dissection microscopy and tissue handling, with initial practice recommended on larger structures like the uterus.
- Needs instrumentation including dissection microscopes, springform micro-scissors, 25-gauge needles, and equipment for RNA extraction and cell analysis.
- Demands cross-team standardization of dissection timing, toluidine blue staining, and cold tissue handling to ensure consistency across users and experiments.
- Involves adaptation considerations for different model systems, as the protocol is optimized for murine oviduct dimensions (200–400 μm diameter).
- Includes practical limitations such as the need to pool infundibular samples from two animals to achieve sufficient RNA yield for downstream assays.
