التشريح المجهري وتفكك قناة المبيض المورينية: تحديد الجزء الفردي وعزل الخلية الواحدة

شرائح قناة البيض المختلفة لها وظائف فسيولوجية متميزة وهي عرضة بشكل تفاضلي للتغير المرضي. يعد تحديد الأجزاء المختلفة في قناة بيض فأر صغيرة جدا أمرا صعبا ، وكذلك إنتاج عائد جيد من الخلايا المتمايزة جيدا عن طريق تفكك الأنسجة. في هذا الفيديو ، سنوضح كيفية فك قناة بيض الفأر ، والتعرف على الأجزاء المختلفة بحيث يمكن تحليلها بشكل فردي ، وأخيرا ، كيفية إنتاج غلة عالية نسبيا من الخلايا المنفصلة المتباينة.

قد يؤدي الفهم الأفضل للبيئة الخاصة بالأمبولا إلى تحسين تقنيات الإخصاب في المختبر. أيضا ، من خلال مقارنة infundibulum مع شرائح أخرى ، قد نفهم بشكل أفضل ميل infundibulum للتحول الخبيث. يقوم إجراء التفكك أحادي الخلية بتحرير الخلايا اللحمية والظهارية من قناة البيض.

توفر طريقتنا أيضا فرصا لتحليل مساهمات الخلايا المناعية والعضلات الملساء والخلايا الظهارية بشكل منفصل في علم وظائف الأعضاء وعلم الأمراض في قناة البيض. قد يكون العمل تحت مجهر التشريح صعبا في البداية. أنصح بالتدرب على أنبوب أكبر مثل الرحم للتأكد من أن أدواتك كافية للتسلخ المجهري لقناة البيض.

ابدأ بلصق قطعة من شمع الأسنان على طبق بتري بمادة لاصقة واتركها تجف. ثم قم بتعقيم الطبق بنسبة 70٪ من الإيثانول. السطح جاهز الآن للتشريح.

شل حركة طبق بتري الذي يحتوي على شمع الأسنان على المنصة الباردة تحت مجهر تشريح عندما يكون جاهزا للتشريح. تطهير السطح البطني للحيوان بنسبة 70٪ من الإيثانول. ثم افتح تجويف البطن والحوض بمقص تشريح معقم.

حرك الجهاز الهضمي إلى جانب واحد لتحديد موقع الرحم الظهري ثنائي القرن. اتبع كل قرن رحمي على السطح لتحديد موقع كل قناة بيض ومبيض مغلفة في وسادة الدهون الرحمية أسفل الكلى مباشرة. ثم قم باستئصال كل من قنوات البيض الجانبية مع المبيضين وجزء من قرن الرحم البعيد الذي لا يزال متصلا باستخدام مقص التشريح.

قطع كل قرن رحمي جانبي مع ما يقرب من واحد إلى اثنين سنتيمترات من القرن لا يزال متصلا بقناة البيض الملفوفة والمبيض. غمر الأنسجة على الفور في ملليلتر من وسط التشريح البارد ، ثم قم بلصق أنسجة الرحم على شمع الأسنان بإبرة قياس 25 معقمة لتأمين الأنسجة للتشريح. تنظيف وتشريح وسادة الدهون المبيض والنسيج الضام لتصور قناة البيض بوضوح.

استخدم حقنة ملليلتر واحدة لتوزيع قطرة إلى قطرتين من محلول صبغة التولويدين الأزرق المعقم بنسبة 1٪ واحتضانه لمدة 30 ثانية إلى دقيقة واحدة. شطف مع DPBS الباردة ثم إزالة كل السائل. اسحب المبيض برفق من قناة البيض الملفوفة.

قطع في الغشاء الجراب في الرباط العريض لإزالة المبيض من قناة البيض دون المساس بالأنسجة البوقية. حدد موقع الطرف الفيمبري البعيد لقناة البيض الموجودة جانبيا لتقاطع البوق الرحمي. اسحب الأنبوب بلطف واقطعه بعيدا عند الميزوسالبينكس باستخدام مقص صغير زنبركي لفك قناة البيض.

قطع الأنبوب لإنتاج المنطقة القاعية. ثم قم باستئصال المنطقة الأمبولية عن طريق القطع بين الدورتين الثانية والثالثة. أخيرا ، قم بقطع الجزء المتبقي إلى تقاطع أنبوب الرحم وهو منطقة البرزخ.

قم على الفور بتجميد أجزاء الأنسجة المشوهة في النيتروجين السائل ثم أضف 200 ميكرولتر من كاشف استخراج الحمض النووي الريبي البارد ومزيج خرزة التجانس الفردي إلى الأنسجة لعزل الحمض النووي الريبي. بدءا من منطقة فيمبرال ، شق الأنبوب طوليا باستخدام مقص زنبركي الشكل واستخدم الملقط كوسيلة ضغط لفضح الظهارة المضيئة. افرم الأجزاء المفتوحة من الشق وقناة البيض المتبقية إلى ما يقرب من جزء واحد إلى مليمترين.

ثم أضف خمسة ملليلترات من العازلة الدافئة غير الأنزيمية إلى الأنسجة واحتضنها عند 37 درجة مئوية. تظهر هنا صور تباين الفلورسنت والطور لعنقود خلوي إيجابي للأوكلودين والنوى والتوبولين الأسيتيلات. الأحمر يدل على أوكلودين ، والأزرق يدل على النوى ، والأخضر يدل على توبولين أسيتيلات.

تبقى الحدود القمية الهدبية سليمة طوال البروتوكول وتقاوم المزيد من الهضم للخلايا المفردة. في هذه الصور التمثيلية ، يتم عرض القنوات المدمجة والحمراء والزرقاء وتباين الطور والخضراء. بعد حضانة pronase قصيرة ، تكون غالبية الخلايا مفردة.

يظهر تلطيخ يوديد البروبيديوم قابلية البقاء بنسبة 93٪ تقريبا في Brightfield ، وإيجابية PI للقناة الحمراء ، والدمج. يظهر التضمين عند الدمج حدا هدبيا سليما على خلية واحدة منفصلة. هذه الخلايا لديها بنشاط ضرب الأهداب.

تم تقييم الحمض النووي الريبي الكامل من حيث الإنتاجية والجودة بواسطة مقياس الطيف الضوئي صغير الحجم والمحلل الحيوي. تظهر النتائج أن هذه الطريقة تنتج 800 إلى 1،200 نانوغرام من الحمض النووي الريبي لكل جزء باستثناء العينات غير القاعية حيث قد يكون التجمع من حيوانين ضروريا للحصول على عائد مناسب للفحوصات النهائية. يتم تجميع النتائج المقدمة ل infundibulum من حيوانين ، يبلغ مجموعهما أربع مناطق غير قابلة للتمويل.

يحقق هذا البروتوكول بنجاح الحمض النووي الريبي النقي الذي تم تحليله باستخدام مقياس الطيف الضوئي صغير الحجم ومحلل حيوي. تحتوي العينات على نسبة امتصاص 260 × 280 نانومتر بين 1.8 و 2 ، وهي نموذجية لأنواع نيوكليوتيدات الحمض النووي الريبي النقية. أظهر التحليل الحيوي للعينات سلامة عالية للحمض النووي الريبي مع تقييم رقم سلامة الحمض النووي الريبي فوق سبعة ، وهو مناسب للتعبير عن المصب وتحليل التسلسل.

تذكر الاحتفاظ بواحد إلى سنتيمترين من قرن الرحم لتثبيت نظام البوق على منصة التشريح. بالإضافة إلى ذلك ، يساعد استخدام صبغة تولويدين الزرقاء في فك اللفائف السريع لقناة البيض. كلما كان فك اللفائف أسرع ، كان الحفظ أفضل وأقل قدر من تحلل الحمض النووي الريبي.

هذه الطريقة كافية للحصول على الحمض النووي الريبي بجودة مناسبة لتسلسل الحمض النووي الريبي مما يسمح بتسلسل المقطع الفردي. يعد تفكك الخلية مناسبا لتسلسل الخلية الواحدة أو قياس التدفق الخلوي مما يسمح بتحليل أكثر دقة للجزء والخلية. ستساعد هذه الطريقة في نقل الحقل إلى ما وراء تحليل الأنبوب بأكمله الذي يخفي الاختلافات على مستوى الشريحة أو الخلية الواحدة.