التحضير البيولوجي والتقنية الميكانيكية لتحديد الخصائص اللزجة المرنة للألياف المناطقية

تكمن أهمية طريقتنا في قدرتها على الإجابة على السؤال ، ما هي الخصائص اللزجة المرنة للألياف المناطقية ، الألياف التي تعلق العدسة داخل العين؟ الميزة الرئيسية لتقنيتنا هي أنها يمكن أن تحدد كميا الخصائص المرنة اللزجة للألياف المناطقية الصغيرة والحساسة من الفئران مع وبدون تعديلات جينية مستهدفة. الطفرات في الجينات التي تشفر بروتينات الألياف الدقيقة تكمن وراء العديد من الحالات المتلازمية الموروثة.

باستخدام تقنيتنا ، يمكننا التحقيق في كيفية تغيير طفرات محددة للخصائص الميكانيكية الحيوية للألياف الدقيقة. للبدء ، بعد القتل الرحيم للفأر ، قم بإزالة العينين باستخدام ملقط ناعم. أدخل طرف إبرة التثبيت عبر جدار العين وضعه في وسط الفكاهة الزجاجية ، مع الحرص على عدم إتلاف العدسة.

انقل العين المنحرفة بعناية إلى أنبوب مملوء ب 4٪ من بارافورمالديهايد ومحلول ملحي مخزن بالفوسفات. افتح الصمام الذي يربط الإبرة بخزان مثبت يقع على ارتفاع 25 سم فوق العينة والذي يحافظ على ضغط إيجابي يعادل 15 إلى 20 ملم من الزئبق داخل العين خلال فترة التثبيت واترك العينة لإصلاحها بين عشية وضحاها. في اليوم التالي ، قم بإزالة إبرة التثبيت واغسل العين لمدة 10 دقائق في محلول ملحي مخزن بالفوسفات.

من خلال استخدام مقص جراحي للعيون ومجهر ستيريو ، قم بعمل شق كامل السماكة في جدار العين بالقرب من رأس العصب البصري. قم بتمديد القطع إلى الأمام نحو خط الاستواء ثم حول المحيط الاستوائي للعين مع تجنب العمليات الهدبية الدقيقة والألياف المناطقية المرتبطة بها بعناية. قم بكشف السطح الخلفي للعدسة عن طريق إزالة الجزء الخلفي من الكرة الأرضية.

قم بإزالة العين المشوهة من المحلول العازل باستخدام الملقط وضعها على مسح جاف للمهمة مع توجيه القرنية لأسفل. اسحب القرنية برفق على سطح المسح لتجفيفها. ضع قطرة من الغراء الفوري على قاع طبق بتري 50 ملم وقم بإصلاح المنصة عليه.

ضع الطبق على طبق المسرح من المجهر ستيريو بحيث يكون البئر مع الغراء في الأفق. لاستيعاب العين في آبار منصة طبق بتري ، أضف ثلاثة ميكرولترات من الغراء الفوري. ضعه بعناية في البئر واضبطه بسرعة بحيث يواجه الجزء الخلفي من العدسة لأعلى.

جفف الجانب المكشوف من العدسة عن طريق النشاف بلطف بزاوية منديل جاف. لقياس الاستجابة اللزجة المرنة المناطقية ، قم بتشغيل الميزان ، وضع طبق Petri على الميزان ، ثم ابدأ تشغيل برنامج تسجيل المقياس وبرنامج الكاميرا. قم بتشغيل وحدة التحكم في المحرك المؤازر.

ابدأ تشغيل تطبيق وحدة التحكم على الكمبيوتر واضبط معلمات الحركة بزيادات قدرها 50 ميكرومتر. إنشاء 90 درجة الانحناء في قضيب الشعرية. انزلق الشعيرات الدموية المنحنية في حامل المسبار الشعري وشد مسامير التأمين.

إلى الطرف الشعري ، أضف حبة صغيرة من غراء المعالجة بالأشعة فوق البنفسجية. حرك طرف المسبار الشعري باستخدام الضبطات اليدوية على المتلاعب وضعه مباشرة فوق الجزء العلوي من العدسة. من خلال الفحص البصري الأمامي والرؤية الجانبية باستخدام كاميرا المجهر ، تحقق من أن الجزء السفلي من غراء الأشعة فوق البنفسجية يبدو متمركزا فوق الجزء العلوي من العدسة.

أثناء النظر من خلال الكاميرا ، اخفض طرف المسبار حتى يتلامس غراء الأشعة فوق البنفسجية مع العدسة ويغطي 1/3 إلى 1/2 من سطحها العلوي. عالج الغراء باستخدام مصدر ضوء الأشعة فوق البنفسجية الاتجاهي شبه المرئي بطول موجي يتراوح بين 380 و 400 نانومتر وكثافة تبلغ حوالي مللي واط. أضف محلول PBS إلى طبق بتري حتى يتم تغطية العين على عمق لا يقل عن مليمترين.

ضع عدسة أسطوانية أمام المجهر وبطريقة قريبة من طبق بتري دون لمسه. في الوقت نفسه ، ابدأ تسجيل الدخول في برنامج مؤقت. التقط صورة للعين والمسبار باستخدام الكاميرا.

بعد 60 ثانية ، ابدأ إزاحة 50 ميكرومتر. كرر كل 60 ثانية حتى تكتمل التجربة كما هو موضح بكسر جميع الألياف الإقليمية. احفظ بيانات تسجيل المقياس عند الانتهاء من التشغيل وقم بتصديرها إلى تنسيق جدول بيانات متوافق.

أيضا ، احفظ صور العدسة التي تم الحصول عليها أثناء التشغيل. استيراد البيانات إلى جدول بيانات. باستخدام قراءة المقياس الأولى والأخيرة ، قم باستجواب الانجراف في قراءة الخلفية بمرور الوقت بسبب التبخر ، ثم اطرح الخلفية المستوفاة من القراءة في كل نقطة زمنية.

بعد إجراء الفحص والتصحيح للتبخر ، يتم عكس الرسم البياني للبيانات المرنة اللزجة. يزداد حجم القوى الفورية والمسترخية مع كل خطوة تصل إلى حوالي 1000 ثانية ، ثم ينخفض مع بدء الألياف المناطقية في الكسر حتى يتم الوصول إلى النقطة الزمنية 1،500 ثانية عندما يتم كسر جميع الألياف. في هذا العرض التوضيحي ، تمت مقارنة الاستجابة اللزجة المرنة للنوع البري والفئران الناقصة MAGP-1 أيضا.

في الوقت الأولي من صفر إلى 600 ثانية ، تشبه الرسوم البيانية بعضها البعض مما يشير إلى أن الخصائص اللزجة المرنة للألياف المناطقية لم تتغير بشكل كبير. ومع ذلك ، في ماوس MAGP-1 بالضربة القاضية ، تنكسر الألياف قبل الأوان. تم الحصول على قوى كسر الألياف المناطقية باستخدام طريقة السحب ل MAGP-1 مقابل الفئران البرية في مراحل عمرها شهر واحد وسنة.

أشارت النتائج إلى أن قوة الألياف تزداد مع تقدم العمر للفئران من النوع البري. قد يؤدي أي اتصال عرضي مع طبق بتري خلال هذه الخطوات إلى تحول جدار العين بالنسبة إلى عدسة العين ، مما قد يؤدي إلى إتلاف الألياف المناطقية. يساعد فحص السحب هذا على تحديد البروتينات التي تساهم في قوة الشد للألياف الدقيقة.

سنستخدم هذه المعلومات لبناء نماذج أكثر واقعية للجزء الداخلي من الألياف الإقليمية.