Name: تحفيز وتحليل تكوين الأعصاب للبالغين في الدماغ المركزي Drosophila (فيديو) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-10-08T14:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 31 s
Description: تعلم بروتوكول إحداث إصابة دماغية اختراقية في ذبابة Drosophila البالغة لتحفيز تكوين الأعصاب ودراسة آليات التجدد العصبي. هذه الطريقة تساعد الباحثين على فهم إمكانية التجدد العصبي في البشر.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

ونحن ممتنون لستايسي ريمكوس وبيكي كاتزنبرغر للمساعدة التقنية وإدواردو مورينو لتقاسم أسهم بيرما التوأم. ونود أن نشكر باري غانيتزكي وديفيد واسارمان على المناقشات الحيوية التي حسنت بلا شك العلم وكينت موك وكايلا غيرا وبيلي شبيجلبرغ على مساهماتهم في المختبر. تم تطوير الأجسام المضادة FasII من قبل كوري غودمان وتم الحصول عليها من بنك Hybridoma للدراسات التنموية ، الذي أنشأه NICHD في المعاهد القومية للصحة وحافظ عليه في جامعة أيوا ، قسم البيولوجيا ، مدينة أيوا ، IA 52242. تم الحصول على معظم سلالات دروسوفيلا المستخدمة في هذه الدراسة من مركز بلومينغتون دروسوفيلا للأسهم (BDSC; المعاهد القومية للصحة P40OD018537). وقد دعم هذا العمل المعهد الوطني للصحة T32 GM007133 (KLC)؛ المعاهد القومية للصحة NS090190 (GBF)؛ المعاهد القومية للصحة NS102698 (GBF)؛ كلية الدراسات العليا بجامعة ويسكونسن (GBF)؛ ومعهد القيادة النسائية في العلوم والهندسة (WISELI) (GBF).

<ol><li>Thurman, D., et al. Report to Congress: Traumatic brain injury in the United States. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.cdc.gov/traumaticbraininjury/pubs/tbi_report_to_congress.html">https://www.cdc.gov/traumaticbraininjury/pubs/tbi_report_to_congress.html</a> (1999).</li>
<li>NIEHS. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.nih.gov/research/supported/health/neurodegenerative/index.cfm">https://www.nih.gov/research/supported/health/neurodegenerative/index.cfm</a> (2021).</li>
<li>Morton, N. V., Wehman, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Psychosocial+and+emotional+sequelae+of+individuals+with+traumatic+brain+injury%3A+A+literature+review+and+recommendations%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Injury%22%5BJournal%5D)">Psychosocial and emotional sequelae of individuals with traumatic brain injury: A literature review and recommendations.</a> Brain Injury. 9 (1), 81-92 (2017).</li>
<li>Bonini, N. M., Berger, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+sustained+impact+of+model+organisms-in+genetics+and+epigenetics%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">The sustained impact of model organisms-in genetics and epigenetics.</a> Genetics. 205, 1-4 (2017).</li>
<li>Brace, E. J., DiAntonio, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Models+of+axon+regeneration+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Neurology%22%5BJournal%5D)">Models of axon regeneration in Drosophila.</a> Experimental Neurology. 287, Pt 3 310-317 (2017).</li>
<li>Hao, Y., Collins, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intrinsic+mechanisms+for+axon+regeneration%3A+insights+from+injured+axons+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Genetics+%26+Development%22%5BJournal%5D)">Intrinsic mechanisms for axon regeneration: insights from injured axons in Drosophila.</a> Current Opinion in Genetics & Development. 44, 84-91 (2017).</li>
<li>Chiang, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+reconstruction+of+brain-wide+wiring+networks+in+Drosophila+at+single-cell+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional reconstruction of brain-wide wiring networks in Drosophila at single-cell resolution.</a> Current Biology. 21 (1), 1-11 (2011).</li>
<li>Meinertzhagen, I. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+organisation+of+invertebrate+brains%3A+cells%2C+synapses+and+circuits%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Zoologica%22%5BJournal%5D)">The organisation of invertebrate brains: cells, synapses and circuits.</a> Acta Zoologica. 91 (1), 64-71 (2010).</li>
<li>Bellen, H. J., Tong, C., Tsuda, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((100+years+of+Drosophila+research+and+its+impact+on+vertebrate+neuroscience%3A+A+history+lesson+for+the+future%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">100 years of Drosophila research and its impact on vertebrate neuroscience: A history lesson for the future.</a> Nature Reviews Neuroscience. 11 (7), 514-522 (2010).</li>
<li>Lessing, D., Bonini, N. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Maintaining+the+brain%3A+insight+into+human+neurodegeneration+from+Drosophila+melanogaster+mutants%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Genetics%22%5BJournal%5D)">Maintaining the brain: insight into human neurodegeneration from Drosophila melanogaster mutants.</a> Nature Reviews Genetics. 10 (6), 359-370 (2009).</li>
<li>Boone, J. Q., Doe, C. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+Drosophila+type+II+neuroblast+lineages+containing+transit+amplifying+ganglion+mother+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Neurobiology%22%5BJournal%5D)">Identification of Drosophila type II neuroblast lineages containing transit amplifying ganglion mother cells.</a> Developmental Neurobiology. 68 (9), 1185-1195 (2008).</li>
<li>Ito, K., Hotta, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proliferation+pattern+of+postembryonic+neuroblasts+in+the+brain+of+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Proliferation pattern of postembryonic neuroblasts in the brain of Drosophila melanogaster.</a> Developmental Biology. 149 (1), 134-148 (1992).</li>
<li>Siegrist, S. E., Haque, N. S., Chen, C. H., Hay, B. A., Hariharan, I. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inactivation+of+both+Foxo+and+reaper+promotes+long-term+adult+neurogenesis+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%22%5BJournal%5D)">Inactivation of both Foxo and reaper promotes long-term adult neurogenesis in Drosophila.</a> Current Biology. 20 (7), 643-648 (2010).</li>
<li>von Trotha, J. W., Egger, B., Brand, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+proliferation+in+the+Drosophila+adult+brain+revealed+by+clonal+analysis+and+bromodeoxyuridine+labelling%5BTitle%5D)+AND+%22Neural+Development%22%5BJournal%5D)">Cell proliferation in the Drosophila adult brain revealed by clonal analysis and bromodeoxyuridine labelling.</a> Neural Development. 4, 9(2009).</li>
<li>Fernandez-Hernandez, I., Rhiner, C., Moreno, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adult+neurogenesis+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Adult neurogenesis in Drosophila.</a> Cell Reports. 3 (6), 1857-1865 (2013).</li>
<li>Crocker, K. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurogenesis+in+the+adult+Drosophila+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Neurogenesis in the adult Drosophila brain.</a> Genetics. , (2021).</li>
<li>Plavicki, J., Mader, S., Pueschel, E., Peebles, P., Boekhoff-Falk, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Homeobox+gene+distal-less+is+required+for+neuronal+differentiation+and+neurite+outgrowth+in+the+Drosophila+olfactory+system%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Homeobox gene distal-less is required for neuronal differentiation and neurite outgrowth in the Drosophila olfactory system.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (5), 1578-1583 (2012).</li>
<li>Aso, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+neuronal+architecture+of+the+mushroom+body+provides+a+logic+for+associative+learning%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">The neuronal architecture of the mushroom body provides a logic for associative learning.</a> Elife. 3, 04577(2014).</li>
<li>Ito, K., Awano, W., Suzuki, K., Hiromi, Y., Yamamoto, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Drosophila+mushroom+body+is+a+quadruple+structure+of+clonal+units+each+of+which+contains+a+virtually+identical+set+of+neurones+and+glial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">The Drosophila mushroom body is a quadruple structure of clonal units each of which contains a virtually identical set of neurones and glial cells.</a> Development. 124 (4), 761-771 (1997).</li>
<li>Tito, A. J., Cheema, S., Jiang, M., Zhang, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simple+one-step+dissection+protocol+for+whole-mount+preparation+of+adult+Drosophila+brains%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Simple one-step dissection protocol for whole-mount preparation of adult Drosophila brains.</a> Journal of Visualized Experiments. (118), e55128(2016).</li>
<li>Kelly, S. M., Elchert, A., Kahl, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dissection+and+immunofluorescent+staining+of+mushroom+body+and+photoreceptor+neurons+in+adult+Drosophila+melanogaster+brains%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Dissection and immunofluorescent staining of mushroom body and photoreceptor neurons in adult Drosophila melanogaster brains.</a> Journal of Visualized Experiments. (129), e56174(2017).</li>
<li>Arain, U., Valentino, P., Islam, I. M., Erclik, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dissection%2C+immunohistochemistry+and+mounting+of+larval+and+adult+Drosophila+brains+for+optic+lobe+visualization%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Dissection, immunohistochemistry and mounting of larval and adult Drosophila brains for optic lobe visualization.</a> Journal of Visualized Experiments. (170), e61273(2021).</li>
</ol>

ولا يوجد بين أصحاب البلاغ تضارب في المصالح.

على الرغم من أن الإصابات المخترقة لدماغ دروسوفيلا البالغ قد وصفت سابقا15,17,18، ركزت هذه الإصابات على الفصوص البصرية وليس الدماغ المركزي. وعلاوة على ذلك، لا توجد حتى الآن تعليمات مفصلة عن كيفية تنفيذ الإصابات. يصف هذا البروتوكول نموذجا لاختراق إصابة الدماغ المركزي Drosophila البالغ الذي يستنسخ أدلة ذات دلالة إحصائية لنشأة الأعصاب للبالغين بعد PTBI.
ويرجع استنساخ هذا البروتوكول PTBI، جزئيا، إلى الجسم الفطر كمنطقة الهدف الإصابة. جسم الفطر كبير ، ويتألف من ~ 2200 خلية عصبية مع التشعب المعقد و أربور المحور في صفائف كبيرة ونمطية للغاية18. تقع أجسام خلايا الخلايا العصبية لجسم الفطر بالقرب من سطح الدماغ ويمكن تصورها من خلال قطع الرأس باستخدام تعبير البروتين الفلوري الأخضر (GFP) (الشكل 1C). سلائف الجسم الفطر هي الخلايا الجذعية العصبية الماضي للخضوع ل موت الخلايا المبرمج خلال development13,12,19. وهكذا، العديد من الخلايا العصبية الجسم الفطر هي صغيرة جدا في وقت الانفجار. وأدى ذلك إلى فرضية أن جسم الفطر قد يكون أكثر إمكانات ميتوتيك من مناطق الدماغ الأخرى16. بالإضافة إلى ذلك ، فإن جسم الفطر أمر بالغ الأهمية للتعلم والذاكرة18. وهذا يسمح للمرء أن يسأل ما إذا كان تكوين الأعصاب PTBI الناجمة يؤدي إلى الانتعاش الوظيفي.
وتشمل العوامل الأخرى التي تسهم في إعادة إنتاج النتائج استخدام الذباب المتقاطع من الأنماط الجينية المتسقة، وأداء الصلبان في نفس الاتجاه في كل مرة، والتحكم بدقة في درجات الحرارة التنشئة والشيخوخة، وتحليل الذكور والإناث على حدة. استخدام الذباب F1 من خارج يقلل من احتمال تحليل العقول homozygous للطفرات العفوية. الصليب القياسي ل y[1] w[1]; UAS-mCD8-GFP;; OK107-GAL4 الإناث الكبار إلى y[1] ث [1] الذكور البالغين الذباب النتائج في ذرية F1 من النمط الجيني y[1] ث [1]; UAS-mCD8-GFP/+;; OK107-GAL4/+. يتم التعبير عن OK107-GAL4 في جميع الخلايا العصبية الجوهرية للجسم الفطر ويدفع التعبير عن مراسل غشاء ملزمة UAS-mCD8-GFP السماح التصور من أجسام الفطر وتوقعاتها. بالنسبة للمتصاليب perma-twin، يجب أن تظل الصلبان عند 17 درجة مئوية في جميع الأوقات للحفاظ على نظام تتبع النسب مغلقا. وهذا يضمن أنه لا توجد خلايا مقسمة وصفت أثناء التنمية وأن يتم تسمية الخلايا العصبية فقط الكبار المولد وغليا. وتحقيقا لهذه الغاية، يمكن أيضا الحفاظ على غرفة الطيران عند 17 درجة مئوية. على الرغم من أن الوصف الأولي للنظام perma-twin15 أوصى الذباب تربية في 18 درجة مئوية، وهذا يمكن أن يؤدي إلى وضع العلامات الخلفية كبيرة.
للاتساق، فمن المستحسن أيضا للحفاظ على السيطرة الذباب غير مصاب على لوحة ثاني أكسيد الكربون كما ينفذ واحد PTBI. وهذا يضمن أن كلا المجموعتين من الذباب لديها التعرض مخدر متطابقة. بالإضافة إلى ذلك ، من المستحسن أن تخترق القابلية للاستنساخ الرأس تماما. ومع ذلك ، يجب الحرص على عدم ثني طرف الدبوس ضد الوسادة ، مما يجعلها غير صالحة للاستخدام للإصابات المستقبلية. بالنسبة للممارسين المهرة ، لا يوجد ضرر غير مقصود يذكر لذباب PTBI. ومع ذلك ، فإن الضغط بشدة على الصدر لتثبيت الذبابة أثناء الإصابة يمكن أن يكون قاتلا. إحدى الطرق لتقييم مدى الإصابة غير المقصودة هي تحديد معدل وفيات ذباب PTBI بعد الإصابة ب 24 ساعة. بالنسبة للذباب المصاب من جانب واحد ، يمكن أن يكون هذا 50٪ أو أعلى للمبتدئين. لذلك ، لضمان أن النتائج الملاحظة ترجع إلى PTBI وليس إلى إصابة غير مقصودة ، ينصح بأن يمارس المبتدئون إدارة PTBI على ~ 20 يطير يوميا على مدى عدة أسابيع ولا يحللون الأدمغة الناتجة حتى يتم <10٪ باستمرار معدل الوفيات 24 ساعة.
لتحديد كمية الانتشار التي يحفزها PTBI الدماغ المركزي، يمكن استخدام كل من مكافحة الفوسفوهيستون H3 (PH3) مناعة و5-إيثينيل-2'-deoxyuridine (EdU) التأسيس. مكافحة PH3 تسميات الخلايا قبل وطوال مرحلة ما بعد الطور، والحد من الكشف عن سوى جزء صغير من الخلايا تقسيم بنشاط. وهكذا، تلطيخ المضادة PH3 يوفر لمحة جزئية فقط من الانتشار. EdU هو التناظرية الثيميدين التي يمكن دمجها في الحمض النووي توليفها حديثا. عن طريق تغذية الذباب EdU قبل وبعد الإصابة، فمن الممكن الحصول على صورة أكثر اكتمالا من الخلايا التي هي إما تقسيم أو قد انقسمت بعد الإصابة. حقيقة أن أي خلايا تنقسم يتم وضع علامة دائمة مفيدة على حد سواء لتحديد الخلايا ركوب الدراجات ببطء و المقايسة بقاء الخلايا بعد الانتشار الأولي. لأسباب غير واضحة، ولكن ربما بسبب نفاذية محدودة من حاجز الدم في الدماغ، ووضع العلامات EdU غير فعالة والتقارير الناقصة انتشار الخلايا في الدماغ الكبار. ويتضح ذلك من الأعداد المماثلة من خلايا PH3+ و EdU+ في كل من العقول التحكمية والتجريبية عند 24 ساعة بعد PTBI ومن خلال ملاحظة أن مجموعة فرعية فقط من الخلايا الجديدة في المستنسخين التوأمين بيرما تتضمن EdU16. لوضع العلامات القصوى ، من الضروري إطعام الذباب مسبقا باستخدام EdU لأن الذباب المصاب لا يستأنف التغذية لعدة ساعات بعد PTBI. تم تقييم التغذية عن طريق إضافة تلوين الطعام إلى محلول EdU ومراقبة كمية الصبغة في الأمعاء من خلال قطع البطن16.
وتجدر الإشارة إلى أنه في حين قدمنا بروتوكول تشريح الدماغ في الخطوة 4، يمكن استخدام تقنيات بديلة. العديد من هذه متوفرة في بروتوكولات المنشورة سابقا20,21,22. Drosophila melanogaster يقدم نموذجا منخفض التكلفة مع أدوات وراثية جزيئية قوية التي يمكن استخدامها لدراسة الآليات الكامنة وراء تجديد أنسجة متعددة، بما في ذلك القناة الهضمية ومكونات الجهاز العصبي. ويرد هنا نموذج جديد للإصابات قابل للاستنساخ يمكن استخدامه لدراسة الاستجابة لإصابة الدماغ. البيانات التي تم الحصول عليها باستخدام هذه البروتوكولات تدعم فكرة أن الدماغ المركزي Drosophila الكبار يحتفظ القدرة على الانتشار، وتوليد خلايا عصبية جديدة ردا على الإصابة. هذه الملاحظات تبرر إجراء مزيد من التحقيق في كل من مدى تكوين الأعصاب الكبار وآلياته الجزيئية الكامنة. بمجرد تحديد المكونات المشاركة في التجديد العصبي في هذا النظام ، يمكننا تحويل معرفتنا بالنشأة العصبية الدروزوفيليا البالغة إلى البشر.

الأضرار التي لحقت الدماغ والجهاز العصبي هو السبب الرئيسي للوفاة والعجز في جميع أنحاء العالم. يعاني ما يقرب من 1.5 مليون أمريكي من إصابات الدماغ الرضية (TBI) كل عام1 ، في حين يعاني ما يقدر ب 6 ملايين شخص في الولايات المتحدة وحدها من أمراض تنكسية عصبية ، مثل مرض باركنسون ومرض الزهايمر2. يمكن أن يسبب كل من المرض وإصابة الدماغ انحطاطا عصبيا ، مما يؤدي إلى عيوب حسية ومعرفية ومحركات3. كان تطوير استراتيجيات علاجية لإصلاح الدماغ البشري صعبا بسبب فسيولوجيا الدماغ المعقدة. توفر الكائنات الحية النموذجية مثل Drosophila melanogaster نظاما بسيطا لتحديد الآليات الأساسية الكامنة وراء التنكس العصبي والأهداف العلاجية المحتملة4.
ذبابة الفاكهة Drosophila melanogaster كان كائنا نموذجيا قويا لأكثر من قرن من الزمان ، والنهوض بمجالات علم الوراثة ، وعلم الأحياء التنموي ، وعلم الأعصاب5،6. الدماغ Drosophila يضم فقط ~ 90،000 neurons7، مليون مرة أقل من متوسط الدماغ البشري8، ولكن لديهم العديد من أوجه التشابه. كل من الإنسان ويطير العقول الاستفادة من الناقلات العصبية GABA, الغلوتامات, أستيل, والأمينات الحيوية الدوبامين والسيروتونين9. يعمل Drosophila والخلايا العصبية البشرية أيضا بشكل مماثل ، مع بنية متشابكة مشتركة وأنواع الخلايا العصبية المماثلة10. حجم الدماغ الأصغر من Drosophila وتوافر تقنيات علم الوراثة المتقدمة ، بالإضافة إلى الحفاظ على الآليات الجزيئية والخلوية والفسيولوجية بين Drosophila والثدييات ، يسمح للباحثين Drosophila بطرح أسئلة غير عملية أو يصعب الإجابة عليها في نماذج الثدييات.
فهمنا الحالي لنشأة الأعصاب للبالغين في دروسوفيلا، سواء أثناء الإصابة المنزلية أو بعدها، لا يزال محدودا. يعرف المزيد عن تكوين الأعصاب أثناء النمو الطبيعي. على سبيل المثال، يتم إنشاء الخلايا العصبية وغليا أثناء التنمية من الخلايا السليفة، ودعا neuroblasts10،11. وقد تم تمييز ما لا يقل عن ثلاثة أنواع مختلفة من الخلايا العصبية في الدماغ المركزي. كل من النوع الأول والنوع الثاني النسب neuroblasts الخروج من دورة الخلية ~ 20-30 ساعة بعد تشكيل puparium12. في المقابل، فإن الأروميات العصبية الجسم الفطر هي آخر لإنهاء انقسام الخلية والقيام بذلك عن طريق موت الخلايا المبرمج التي تعتمد على ريبر ~ 85-90 ساعة بعد تشكيل puparium13. بعد انهيار الدماغ ، والدماغ Drosophila الكبار لديها عدد قليل من الخلايا الفاصلة (~ 1 الخلية / الدماغ) ، في الغالب glia14. تمتلك الفصوص البصرية البالغة الأرومات العصبية القادرة على تكوين الأعصاب ببطء15 ، في حين أن الدماغ المركزي البالغ ليس لديه أرومة عصبية معروفة. ندرة السلف العصبية وانتشار الخلايا المحدودة يشبه بقوة الوضع في دماغ الثدييات البالغة ، مما يؤكد على الأهمية المحتملة لآليات تكوين الأعصاب للبالغين في دروسوفيلا للبشر.
أدى اكتشاف مستويات منخفضة من تكوين الأعصاب للبالغين في الفصوص البصرية Drosophila البالغة بعد الإصابة15 إلى فرضية أن الدماغ المركزي Drosophila البالغ قد يكون قادرا أيضا على تكوين الأعصاب البالغ16. يصف هذا البروتوكول إنشاء نموذج صارم وقابل للاستنساخ لإصابة الدماغ المركزية في Drosophila البالغة التي يمكن استخدامها للتحقيق في تكوين الأعصاب في الدماغ المركزي للبالغين. وبالنظر إلى أوجه التشابه بين بنية الدماغ البشرية وبنية الدماغ الدروزوفيلا ووظيفتها، يمكن أن تؤدي هذه الاكتشافات إلى تحديد أهداف حاسمة لنشأة الأعصاب العلاجية في الأدمغة البشرية المصابة والمرضى.

<table><tbody><tr><td># 11 مشارط يمكن التخلص منها سانتا</td><td>كروز التكنولوجيا الحيوية</td><td>sc-395923</td><td>تستخدم لفصل رؤوس ذبابة الفاكهة عن جذوع قبل تشريح الدماغ</td></tr><tr><td>أطباق سيلجارد السوداء بقطر 150 مم</td><td>1696157</td><td>صنع داو في المختبر مع كواشف من داو ؛ تستخدم لتشريح الدماغ</td><td></td></tr><tr><td>18 مم أغطية</td><td>أي</td><td></td><td>لتركيب الأدمغة على شرائح</td></tr> <tr><td>المجهر4 '، 6-Diamidino-2-Phenylindole ، ثنائي هيدروكلوريد (DAPI)</td> <td>ThermoFisher</td><td>D1306</td><td>للكيمياء المناعية</td></tr><tr><td>70٪ إيثانول</td><td>مصنوع من 95٪ إيثانول مصدره مختلف</td><td></td><td></td></tr><tr><td>مضاد للفأر Cy5</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>715-175-151</td><td>للكيمياء المناعية</td></tr><tr><td>المضادة للأرانب 568</td><td>ThermoFisher</td><td>A11036</td><td>للكيمياء المناعية</td></tr><tr><td>للأبقار ألبومين المصل (BSA)</td> <td>SIgma Aldrich</td><td>A7030</td><td>للكيمياء المناعية</td></tr><tr><td>طلاء الأظافر الشفاف</td><td>لأي</td><td></td><td>لختم أغطية</td></tr><tr><td>الختم طقم وضع العلامات Click-It EdU</td><td>InVitrogen</td><td>C10640</td><td>للكشف عن الحمض النووي المركب</td></tr><tr><td>حديثا CO2 bubbler</td><td>Genesee Scientific</td><td>59-181</td><td>للتخدير</td></tr><tr><td>CO2 وسادة</td><td>Genesee Scientific</td><td>59-114</td><td>للتخدير</td></tr><tr><td>CO2 منظم وتوريد</td><td>أي</td><td></td><td>للتخدير</td></tr><tr><td>المجهر متحد البؤر</td><td>أي</td><td></td><td>لتصوير سدادات قطنية ثابتة وملطخة ومثبتة</td></tr><tr><td></td><td>Genesee Scientific</td><td>51-101</td><td>لوضع العلامات</td></tr><tr><td>على EdU ذبابة الفاكهة قوارير</td><td>Genesee Scientific</td><td>32-109</td><td>ل EdU وضع العلامات</td></tr><tr><td>إصلاح المخزن المؤقت (الأنابيب ، EGTA ، المغنيسيوم ؛ PEM)</td> <td>مكونات مصدرها شركات مختلفة</td><td></td><td>لإصلاح أدمغة البالغين ؛ 100 ملي مولار بيبيرازين-N ، N'-bis (2-حمض إيثان سلفونيك) [PIPES] ، 1 ملي مولار EGTA ، 1 ملي مولار MgSO4 ، درجة الحموضة 7.0</td></tr><tr><td>الفورمالديهايد</td><td>سيجما ألدريتش</td><td>252549</td><td>لإصلاح أدمغة البالغين ، تمت إضافتها إلى</td></tr><tr><td>مرشحات واتمان المستديرة PEM Grade 3 ، 23 مم دائرية</td><td>Tisch Scientific</td><td>1003-323</td><td>لوضع العلامات على EdU</td></tr><tr><td>أنابيب الطرد الدقيق</td><td>أي</td><td></td><td>لتثبيت وتلوين ردود الفعل ولتخزين دبابيس Minutien شرائح</td></tr><tr><td>المجهر</td><td>أي</td><td></td><td>لتركيب الأدمغة</td></tr><tr><td>دبابيس Minutien</td><td>أدوات العلوم</td><td>الدقيقة 26002-10</td><td>لإصابات الدماغ; 12.5 & طرف قطر م و 100 مو ؛ قطر m قضيب</td></tr><tr><td>فأر مضاد للفاسيكلين II</td><td>الدراسات التنموية بنك الورم الهجين</td><td>1D4-s</td><td>للكيمياء المناعية</td></tr><tr><td>NIGHTSEA مجهر ستيريو محول مضان</td><td>علوم المجهر الإلكتروني</td><td>SFA-GR</td><td>إعداد التألق لتشريح المجهر</td></tr><tr><td>P20 و P200 و P1000 الماصات ونصائح</td><td>أي</td><td></td><td>لقياس حلول</td></tr><tr><td>الفوسفات السالين المخزن (PBS)</td><td>مكونات مصدرها شركات مختلفة</td><td></td><td>لتشريح الأدمغة وصنع محاليل حجب وغسيل الكيمياء المناعية ؛ 100 ملي مولار من K2HPO4 ، 140 ملي مولار من كلوريد الصوديوم ، درجة الحموضة 7.0</td></tr><tr><td>فوسفات محلول ملحي مخزن مع 0.1٪ مكونات Triton X-100 (PT)</td> <td>مصدرها شركات</td><td></td> مختلفة <td>لغسل الأدمغة المقطعة</td></tr><tr><td>فوسفات محلول ملحي مخزن مع 0.1٪ Triton X-100 + 2٪ ألبومين مصل بقري (PBT)</td><td>المكونات التي يتم الحصول عليها من مختلف الشركات</td><td></td><td>التي تمنع الحل للكيمياء المناعية ولتخفيف الأجسام المضادة</td></tr><tr><td>للأرانب المضادة ل PH3</td><td>Santa Cruz Biotechnology، Inc</td><td>sc-8656-R</td><td>لتسميات التعزيز للكيمياء المناعية</td></tr><tr><td></td><td>Avery</td><td>5721</td><td>للحفاظ على مسافة بين شريحة المجهر وفرشاة الرسم</td></tr><tr><td>بحجم 0</td><td></td><td></td> <td>أيللتلاعب بذبابة الفاكهة البالغة وتثبيتها أثناء الإصابة</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma Aldrich</td><td>93443</td><td></td></tr><tr><td>زوجان من ملقط صانعي الساعات # 5</td><td>أدوات العلوم الدقيقة</td><td>11255-20</td><td>المستخدمة لتثبيت دبابيس Minutien وتشريح الدماغ</td></tr><tr><td>Vectashield</td><td>Vector Laboratories</td><td>H-1000</td><td>وسيط تركيب لشرائح المجهر</td></tr></tbody></table>

تحفيز وتحليل تكوين الأعصاب للبالغين في الدماغ المركزي drosophila

Stimulating and Analyzing Adult Neurogenesis in the Drosophila Central Brain

الآليات الجزيئية والخلوية الكامنة وراء تكوين الأعصاب استجابة للمرض أو الإصابة ليست مفهومة جيدا. ومع ذلك ، فإن فهم هذه الآليات أمر بالغ الأهمية لتطوير العلاجات العصبية التجديدية. Drosophila melanogaster هو نموذج رائد لدراسات التطور العصبي ولكن تاريخيا لم يتم استغلالها للتحقيق في تجديد الدماغ الكبار. ويرجع ذلك في المقام الأول إلى أن الدماغ البالغ يظهر نشاطا متزمنا منخفضا جدا. ومع ذلك، اختراق إصابات الدماغ الرضية (PTBI) إلى الدماغ المركزي Drosophila الكبار يؤدي إلى توليد خلايا عصبية جديدة وجليا جديدة. الأدوات الوراثية القوية المتاحة في Drosophila جنبا إلى جنب مع بروتوكول الإصابة بسيطة ولكنها صارمة وصفها هنا الآن جعل الدماغ Drosophila الكبار نموذجا قويا لأبحاث التجديد العصبي. وفيما يلي تعليمات مفصلة عن (1) اختراق إصابات الدماغ المركزي الكبار و (2) تشريح، الكيمياء المناعية، والتصوير بعد الإصابة. هذه البروتوكولات تسفر عن نتائج قابلة للاستنساخ للغاية، وسوف تسهل دراسات إضافية لتشريح الآليات الكامنة وراء التجديد العصبي.

توفر هذه المقالة بروتوكولات مفصلة لإلحاق اختراق إصابات الدماغ الرضية (PTBI) للبالغين Drosophila وفحص التكوين العصبي الناتج.

تحفيز وتحليل تكوين الأعصاب للبالغين في الدماغ المركزي Drosophila

The molecular and cellular mechanisms underlying neurogenesis in response to disease or injury are not well understood. However, understanding these ...

هذا البروتوكول مهم لأنه يوضح طريقة إصابة الدماغ المركزية التي تؤدي إلى تكوين الأعصاب للبالغين في دروسوفيلا ، حيث لا يوجد عادة. نتوقع أن استخدام هذه التقنية لفهم الآليات الجزيئية الكامنة وراء تكوين الأعصاب الكبار ستكون ذات صلة للتجديد العصبي البشري. تعلم هذه التقنية يتطلب الصبر والمثابرة.نوصي بممارسة الرياضة على خمسة إلى عشرة أدمغة يوميا لعدة أسابيع قبل جمع الأدمغة للتحليل. بعد تخدير الذباب على وسادة ثاني أكسيد الكربون. فرز eclosed حديثا F1 الذباب الذكور الشباب في غضون ست ساعات من الانفجار ووضعها في قوارير نظيفة تحتوي على المواد الغذائية مع 40 أو أقل الذباب لكل قارورة.إذا كان التخطيط لتسمية الخلايا الفاصلة مع EdU إعداد 200 ميكرولتر من 50 مطحنة أو أكثر EdU في 10٪ السكروز ووضع الحل المعد على ورقة تصفية 23 ملليمتر الجولة الثالثة في قارورة فارغة، ثم وضع الذباب الذكور في القارورة للتغذية المسبقة قبل ست ساعات من الإصابة. بعد ذلك، تعقيم دبابيس مينوتين عن طريق وضع ما يقرب من 100 دبابيس في أنبوب الطرد المركزي الدقيق 1.5 ملليلتر مليئة 70٪ الإيثانول لمدة خمس دقائق. ثم تعقيم لوحة ثاني أكسيد الكربون وفرشاة الطلاء عن طريق رش الإيثانول 70٪ ومسح الجافة مع الأنسجة النظيفة خالية من الوبر.بمجرد تنظيف الأدوات وجفافها ، قم بنقل 40 أو أقل من الذكور F1 المفرزين على اللوحة النظيفة وفصلهم إلى مجموعتين. مجموعة واحدة ستكون بمثابة الذباب غير المصاب السيطرة. والمجموعة التجريبية الثانية ستخضع لإصابة دماغية صادمةبعد ذلك ، باستخدام ملقط سحب أربعة إلى خمسة دبابيس مينوتين جديدة من أنبوب الطرد المركزي الصغيرة ووضعها بالقرب من حافة لوحة ثاني أكسيد الكربون. ثم تحت نطاق تشريح اختيار دبوس Minutien على التوالي مع نقطة حادة. أعد استخدام الدبابيس الحادة وضع دبابيس تالفة أو حادة في أنبوب منفصل يحتوي على 70٪ من الإيثانول للتخلص الآمن.بعد ذلك ، بالنسبة للذباب مع مفتاح النمط الجيني القياسي على مصباح LED المجهر ستيريو مجهزة مرشحات الإثارة والانبعاثات المناسبة للبروتين الفلوري الأخضر الذي يسمح الإثارة في 440 إلى 460 نانومتر ويسمح التصور في 500 إلى 560 نانومتر. ثم اختر ذبابة المجموعة التجريبية ووضع ذبابة بحيث المجرب لديه وجهة نظر ظهرية من كبسولة الرأس مع رئيس الذباب إلى اليمين. باستخدام ملقط التقاط وعقد دبوس مينوتين المحدد في يد واحدة، وفرشاة الطلاء في اليد الأخرى.ثم ضع الفرشاة على الجزء الأمامي من الصدر الظهري وادفع لأسفل بلطف لتثبيت الذبابة. تهدف طرف دبوس مينوتين في أجسام الخلايا فطر الهيئات على الجانب الأيمن من الرأس واختراق كبسولة الرأس. إذا كان استخدام المعالم يستهدف قطع الرأس الظهرية بين الocelli والحافة الظهرية للعين.بعد الانتهاء من الإصابة، استخدم فرشاة الطلاء لدفع الرأس بلطف من دبوس مينوتين. إذا كان استخدام الدماغ لتسلسل الحمض النووي الريبي أو QRT PCR تجعلنا إصابة ثانية على الجانب الأيسر من الرأس. مرة واحدة وقد أصيب جميع الذباب التجريبية مكان السيطرة والذباب المصاب في قوارير منفصلة وصفت تحتوي على الغذاء.وضع قوارير أفقيا لمنع الذباب من الوقوع في الطعام. ضع الذباب الصلب القياسي عند 25 درجة مئوية ويطير البيرماوين عند 30 درجة مئوية إلى العمر. إذا الشيخوخة أطول من 24 ساعة نقل الذباب على الغذاء النظيف كل يوم إلى يومين.ولوحظت زيادة كبيرة في الانتشار بعد 24 ساعة من الإصابة باستخدام مضاد لhH3 علامة للخلايا التي تمر بنشاط الانقسام. ويلاحظ ما يقرب من ثلاث خلايا إيجابية pH3 في كل من العقول المركزية السيطرة. و11 خلية إيجابية من نوع PH3 في كل من الأدمغة المركزية المصابة.بحلول سبعة أيام، ما معدله 2 خلايا إيجابية EdU موجودة في كل من أدمغة الخلية التحكم. و 11 خلايا إيجابية EdU في كل من العقول المركزية المصابة، وهو ما يشبه النتائج التي تم الحصول عليها 24 ساعة بعد الإصابة مع الأجسام المضادة pH3. في 14 يوما الضوابط بلغ متوسط خلية إيجابية EdU واحد لكل الدماغ المركزي، والأدمغة المصابة بلغ متوسط 29 خلايا إيجابية EdU لكل الدماغ المركزي.مما يدل على أن انتشار الخلايا يستمر على الأقل في الأسبوع الثاني بعد إصابة الدماغ الرضية اختراق. ويلاحظ أقوى استجابة التكاثر في الدماغ المركزي عندما يصاب الأدمغة في غضون الساعات ال 24 الأولى بعد انهيار الدماغ. وبحلول سبعة أيام بعد الانهيار، لا تزال الإصابة المخترقة تسبب زيادة كبيرة في الانتشار.ومع ذلك ، بحلول 14 يوما ، تنخفض قدرة الخلايا على الانقسام بشكل كبير إلى خلية واحدة مقسمة لكل دماغ. وهو مشابه لتلك التي من السيطرة على العقول. وباستخدام نظام وضع العلامات على البيرماتين، تم الكشف عن المزيد من استنساخ البيرماتين في عينات مصابة في يومين، في غضون أسبوعين، مقارنة بالضوابط.مع تزايد عدد المستنسخين مع مرور الوقت بعد الإصابة. بعد أسبوعين من الإصابة كانت هناك خلايا عصبية جديدة لجسم الفطر في 50٪ من الأدمغة المصابة. هذه الخلايا العصبية الجديدة المتوقعة dendrites ما يقرب من calyx الجسم الفطر، والمؤشر إلى فصوص الجسم الفطر.وتشمل المناطق الأخرى من الدماغ التي يبدو أنها تتجدد فصوص هوائي الجسم الإهليلجي والقرن الجانبي. تأكد من استخدام دبوس Minutien حادة عند القيام إصابات الدماغ واستخدام دبوس مملة أو عازمة سوف تزيد من معدل الوفيات. تأكد أيضا من عدم الضغط بقوة على الذباب مع فرشاة الطلاء لأن هذا سيزيد أيضا من معدل الوفيات.بعد هذا الإجراء، يمكن استخدام الكيمياء المناعية لقياس الانتشار الذاتي وأيضا لتحديد الخلايا العصبية الجديدة والغليا.

stimulating-analyzing-adult-neurogenesis-drosophila-central

Research

JoVE Journal

Neuroscience

علم الأعصاب

وصف هذه المقالة على الطريقة التي يمكن لأحد أن...

السابقين التثقيف المجراة من الجامعة، تطوير الأمخاخ ذبابة الفاكهة

يوضح هذا الفيديو بروتوكولا لتحديد العوامل الخارجية التي تبدأ في إعادة تنشيط ذبابة الفاكهة الخلايا الجذعية العصبية للدماغ من حالتها الهادئة. يتم تشريح اليرقات الحديثة الفقس لعزل أدمغتها ، والتي يتم زراعتها بعد ذلك في وسائط مع أو بدون هرمون اختبار لتقييم قدرة الهرمون على تحفيز إعادة تنشيط الخلايا الجذعية العصبية وتكاثرها.

تحليل إعادة تنشيط الخلايا الجذعية العصبية في مستخلصات ذبابة الفاكهة المزروعة للدماغ

يوضح هذا الفيديو تحريض إصابات الدماغ الرضحية المخترقة في ذبابة الفاكهة. يتم اختيار الذباب الناشئة حديثا وتخديرها ووضعها تحت مجهر استريو مجهز بالفلورة. يتم تحديد جسم الفطر المعبر عن GFP ، ويتم إدخال دبوس Minutien لإحداث إصابة. يسمح للذباب بالتعافي لمزيد من الدراسات.

إحداث إصابات الدماغ الرضحية المخترقة في ذبابة الفاكهة البالغة

نحن هنا وصف اثنين من المقايسات التي تم وضعها لدراسة تنكس عصبي التي تعتمد على سن الدوبامين (DA) الخلايا العصبية...

تقييم الظواهر الاعصاب في<em&gt; ذبابة الفاكهة</em&gt; الخلايا العصبية الدوبامين عن طريق تسلق فحوصات والجامعة المناعية الدماغ

هذا البروتوكول تفاصيل طريقة مبسطة تستخدم لإجراء التصوير الخلية الحية في سياق الدماغ اليرقات سليمة. النهج التصوير الخلية الحية لا تقدر بثمن لدراسة الخلايا الجذعية العصبية الانقسامات غير المتماثلة فضلا عن العمليات العصبية والتنموية الأخرى، كشف باستمرار الآليات التي تم تجاهلها سابقا.

التصوير المباشر ل<em&gt; ذبابة الفاكهة</em&gt; اليرقات Neuroblasts

يصف هذا البروتوكول بالتشريح وإيمونوستينينج من الكبار melanogaster المورفولوجية أنسجة الدماغ. على وجه التحديد، يبرز هذا البروتوكول استعمال المورفولوجية فطر الجسم وعلم الخلايا العصبية كمثال على مجموعات فرعية الخلايا العصبية التي يمكن استخدامها بدقة لكشف المبادئ العامة التي تقوم عليها العديد من جوانب التنمية العصبية.

تشريح وتلطيخ إيممونوفلوريسسينت للفطر الجسم وعلم الخلايا العصبية في أدمغة البالغين melanogaster المورفولوجية

ويصف هذا البروتوكول وسيلة لتسجيل النشاط الكهربائي تنازلي للنظام العصبي المركزي melanogaster المورفولوجية لتمكين فعالة من حيث التكلفة ومريحة لاختبار وكلاء الدوائية، الطفرات الوراثية للبروتينات العصبية، و/أو دور مسارات الفيزيولوجية غير مستكشفة.

تسجيل الكهربية لنشاط الجهاز العصبي المركزي للطور الثالث Melanogaster المورفولوجية

نحن نقدم طريقة مصممة خصيصا لتصوير الدماغ كله من Drosophila الكبار أثناء السلوك واستجابة للمحفزات. يتم وضع الرأس للسماح بالوصول البصري إلى الدماغ كله ، في حين أن الذبابة يمكن أن تحرك ساقيها والهوائيات ، وطرف خرطوم ، ويمكن للعيون تلقي المحفزات الحسية.

إعداد الكبار Drosophila melanogaster لتصوير الدماغ كله أثناء السلوك والمحفزات الاستجابات

تحليل دورة الخلية مع 5-إيثيل-2'-deoxyuridine (EdU) وفوسفو-هيستون H3 (pH3) وضع العلامات هو إجراء متعدد الخطوات التي قد تتطلب التحسين واسعة النطاق. هنا، نقدم بروتوكول مفصل يصف جميع الخطوات لهذا الإجراء بما في ذلك تحليل الصورة وتحديد كميتها لتمييز الخلايا في مراحل دورة الخلية المختلفة.

5-إيثينيل-2'-Deoxyuridine/فوسفو-هيستون H3 بروتوكول وضع العلامات المزدوجة لتحليل تطور دورة الخلية في الخلايا الجذعية العصبية Drosophila

تم إنشاء طريقة لإعادة تنشيط الخلايا الجذعية العصبية الهادئة في خلايا دماغ ذبابة الفاكهة المستزرعة . باستخدام هذه الطريقة ، يمكن فصل دور الإشارات الجهازية عن الإشارات الجوهرية للأنسجة في تنظيم هدوء الخلايا الجذعية العصبية ودخولها وخروجها.

إعادة تنشيط الخلايا الجذعية العصبية في ذبابة الفاكهة المستزرعة في الدماغ

من العوائق الكبيرة لدراسة النشاط الخلوي أثناء العمليات المعرفية مثل التعلم والذاكرة استخدام التخدير لإعداد التصوير في الجسم الحي . يضعف التخدير الذاكرة والإدراك على المدى القصير في نماذج متعددة ، بما في ذلك ذبابة الفاكهة. تقدم هذه الدراسة طريقة فريدة لتحضير ذبابة الفاكهة للبالغين للتصوير في الجسم الحي بدون تخدير.

في الجسم الحي تصوير النشاط العصبي في ذبابة الفاكهة البالغة غير المخدرة

تعلم بروتوكول إحداث إصابة دماغية اختراقية في ذبابة Drosophila البالغة لتحفيز تكوين الأعصاب ودراسة آليات التجدد العصبي. هذه الطريقة تساعد الباحثين على فهم إمكانية التجدد العصبي في البشر.

تحفيز وتحليل تكوين الأعصاب للبالغين في الدماغ المركزي Drosophila

استكشف المزيد من الفيديوهات