Name: إعادة تنشيط الخلايا الجذعية العصبية في ذبابة الفاكهة المستزرعة في الدماغ (فيديو) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-05-18T14:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 54 s
Description: تعلم طريقة إعادة تنشيط الخلايا الجذعية العصبية الكامنة في شرائح دماغ Drosophila المستزرعة. تساعد هذه التقنية الباحثين على دراسة آليات الخمول والتنشيط لتحسين علاجات الخلايا الجذعية.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

نحن نعترف ببرنامج LSAMP Bridges to Doctorate للتمويل (CNK) وكذلك NIH / NIGMS (R01-GM120421 و R35-GM141886). ونحن ممتنون للدكتور كونور سيب على الشكل 1. كما نشكر جميع أعضاء مختبر Siegrist على دعمهم المستمر وإرشادهم. ونشكر بشكل خاص تشافي سود وغاري تيترز على قراءتهما المتأنية للمخطوطة وعلى تقديمهما تعليقاتهما.

<ol><li>Suman, S., Domingues, A., Ratajczak, J., Ratajczak, M. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Potential+clinical+applications+of+stem+cells+in+regenerative+medicine%5BTitle%5D)+AND+%22Advances+in+Experimental+Medicine+and+Biology%22%5BJournal%5D)">Potential clinical applications of stem cells in regenerative medicine.</a> Advances in Experimental Medicine and Biology. 1201, 1-22 (2019).</li>
<li>Tabar, V., Studer, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pluripotent+stem+cells+in+regenerative+medicine%3A+challenges+and+recent+progress%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Genetics%22%5BJournal%5D)">Pluripotent stem cells in regenerative medicine: challenges and recent progress.</a> Nature Reviews Genetics. 15, 82-92 (2014).</li>
<li>Daley, G. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stem+cells+and+the+evolving+notion+of+cellular+identity%5BTitle%5D)+AND+%22Philosophical+Transactions+of+the+Royal+Society+of+London.+Series+B%2C+Biological+Sciences%22%5BJournal%5D)">Stem cells and the evolving notion of cellular identity.</a> Philosophical Transactions of the Royal Society of London. Series B, Biological Sciences. 370, 20140376(2015).</li>
<li>Rodrigues, M., Kosaric, N., Bonham, C. A., Gurtner, G. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wound+healing%3A+A+cellular+perspective%5BTitle%5D)+AND+%22Physiological+Reviews%22%5BJournal%5D)">Wound healing: A cellular perspective.</a> Physiological Reviews. 99, 665-706 (2019).</li>
<li>van Velthoven, C. T. J., Rando, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stem+cell+quiescence%3A+Dynamism%2C+restraint%2C+and+cellular+idling%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Stem cell quiescence: Dynamism, restraint, and cellular idling.</a> Cell Stem Cell. 24, 213-225 (2019).</li>
<li>Chapman, N. M., Boothby, M. R., Chi, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolic+coordination+of+T+cell+quiescence+and+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Immunology%22%5BJournal%5D)">Metabolic coordination of T cell quiescence and activation.</a> Nature Reviews Immunology. 20, 55-70 (2020).</li>
<li>Wosczyna, M. N., Rando, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+muscle+stem+cell+support+group%3A+Coordinated+cellular+responses+in+muscle+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Cell%22%5BJournal%5D)">A muscle stem cell support group: Coordinated cellular responses in muscle regeneration.</a> Developmental Cell. 46, 135-143 (2018).</li>
<li>Homem, C. C., Knoblich, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drosophila+neuroblasts%3A+a+model+for+stem+cell+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Drosophila neuroblasts: a model for stem cell biology.</a> Development. 139, 4297-4310 (2012).</li>
<li>Kang, K. H., Reichert, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Control+of+neural+stem+cell+self-renewal+and+differentiation+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+and+Tissue+Research%22%5BJournal%5D)">Control of neural stem cell self-renewal and differentiation in Drosophila.</a> Cell and Tissue Research. 359, 33-45 (2015).</li>
<li>Chell, J. M., Brand, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nutrition-responsive+glia+control+exit+of+neural+stem+cells+from+quiescence%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Nutrition-responsive glia control exit of neural stem cells from quiescence.</a> Cell. 143, 1161-1173 (2010).</li>
<li>Sousa-Nunes, R., Yee, L. L., Gould, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fat+cells+reactivate+quiescent+neuroblasts+via+TOR+and+glial+insulin+relays+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Fat cells reactivate quiescent neuroblasts via TOR and glial insulin relays in Drosophila.</a> Nature. 471, 508-512 (2011).</li>
<li>Britton, J. S., Edgar, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Environmental+control+of+the+cell+cycle+in+Drosophila%3A+nutrition+activates+mitotic+and+endoreplicative+cells+by+distinct+mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Environmental control of the cell cycle in Drosophila: nutrition activates mitotic and endoreplicative cells by distinct mechanisms.</a> Development. 125, 2149-2158 (1998).</li>
<li>Lin, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extremes+of+lineage+plasticity+in+the+Drosophila+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Current+biology+%3A+CB%22%5BJournal%5D)">Extremes of lineage plasticity in the Drosophila brain.</a> Current biology : CB. 23, 1908-1913 (2013).</li>
<li>Sipe, C. W., Siegrist, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Eyeless+uncouples+mushroom+body+neuroblast+proliferation+from+dietary+amino+acids+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">Eyeless uncouples mushroom body neuroblast proliferation from dietary amino acids in Drosophila.</a> Elife. 6, 26343(2017).</li>
<li>Speder, P., Brand, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systemic+and+local+cues+drive+neural+stem+cell+niche+remodelling+during+neurogenesis+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">Systemic and local cues drive neural stem cell niche remodelling during neurogenesis in Drosophila.</a> Elife. 7, 30413(2018).</li>
<li>Yuan, X., Sipe, C. W., Suzawa, M., Bland, M. L., Siegrist, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dilp-2-mediated+PI3-kinase+activation+coordinates+reactivation+of+quiescent+neuroblasts+with+growth+of+their+glial+stem+cell+niche%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biology%22%5BJournal%5D)">Dilp-2-mediated PI3-kinase activation coordinates reactivation of quiescent neuroblasts with growth of their glial stem cell niche.</a> PLoS Biology. 18, 3000721(2020).</li>
<li>Colombani, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+nutrient+sensor+mechanism+controls+Drosophila+growth%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">A nutrient sensor mechanism controls Drosophila growth.</a> Cell. 114, 739-749 (2003).</li>
<li>Geminard, C., Rulifson, E. J., Leopold, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Remote+control+of+insulin+secretion+by+fat+cells+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Metabolism%22%5BJournal%5D)">Remote control of insulin secretion by fat cells in Drosophila.</a> Cell Metabolism. 10, 199-207 (2009).</li>
<li>Siller, K. H., Serr, M., Steward, R., Hays, T. S., Doe, C. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live+imaging+of+Drosophila+brain+neuroblasts+reveals+a+role+for+Lis1%2Fdynactin+in+spindle+assembly+and+mitotic+checkpoint+control%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Biology+of+the+Cell%22%5BJournal%5D)">Live imaging of Drosophila brain neuroblasts reveals a role for Lis1/dynactin in spindle assembly and mitotic checkpoint control.</a> Molecular Biology of the Cell. 16, 5127-5140 (2005).</li>
<li>Prithviraj, R., Trunova, S., Giniger, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ex+vivo+culturing+of+whole%2C+developing+Drosophila+brains%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Ex vivo culturing of whole, developing Drosophila brains.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (65), e4270(2012).</li>
<li>Bostock, M. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+immobilization+technique+for+long-term+time-lapse+imaging+of+explanted+drosophila+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Cell+and+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">An immobilization technique for long-term time-lapse imaging of explanted drosophila tissues.</a> Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 590094(2020).</li>
<li>Datta, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activation+of+neuroblast+proliferation+in+explant+culture+of+the+Drosophila+larval+CNS%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Research%22%5BJournal%5D)">Activation of neuroblast proliferation in explant culture of the Drosophila larval CNS.</a> Brain Research. 818, 77-83 (1999).</li>
</ol>

ليس لدى المؤلفين مصالح متنافسة.

يمكن تنفيذ الطريقة الموصوفة هنا لزراعة الدماغ في معظم بيئات المختبرات. الأدوات المطلوبة ، وكذلك الإجراءات وجمع البيانات ، بسيطة ومباشرة. باستخدام هذه الطريقة ، يمكن للمرء اختبار مجموعة متنوعة من الفرضيات ، بما في ذلك تلك المتعلقة بشلالات إشارات الخلايا والعوامل الخارجية التي تنظم إعادة تنشيط NB وانتشاره. هنا ، باستخدام أوريغون آر البرية ، وجدنا أن الأنسولين الخارجي كان كافيا لإعادة تنشيط NBs من السكون بشكل مستقل عن الإشارات الجهازية الأخرى الخاصة بالحيوانات. باستخدام نظام GAL4 / UAS ، يمكن للمرء أيضا هدم مكونات مسار الأن...

الخلايا الجذعية ذات أهمية كبيرة بسبب إمكانية استخدامها في الطب التجديدي 1,2. تحتفظ العديد من الحيوانات ، وخاصة تلك التي تعيش طويلا ، بالخلايا الجذعية داخل أنسجتها البالغة. تعمل هذه الخلايا الجذعية المقيمة للحفاظ على توازن الأنسجة وتستخدم للإصلاح بعد الإصابة الجسدية أو المرض 3,4. معظم الخلايا الجذعية في الحيوانات البالغة هادئة ، وهي حالة نائمة نسبيا تتميز باحتجاز دورة الخلية وتعطيل إشارات النمو5. استجابة للإشارات الخارجية ، تخرج الخلايا الجذعية من السكون ، وتدخل دورة الخلية وتبدأ في توليد ذرية ابنة خاصة بنوع أنسجتها. على سبيل المثال ، من أجل تركيب استجابة مناعية فعالة ، تحفز الخلايا التي تقدم المستضدات الخلايا التائية الساذجة الهادئة على الدخول في دورة الخلية وتوسيع6 نسخيا. استجابة لتلف العضلات الهيكلية ، تدخل الخلايا الجذعية الساتلية للعضلات دورة الخلية وتولد الأرومات العضلية الابنة لتحل محل myofibrils التالفة 5,7. في حين أنه من الواضح أن الخلايا الجذعية الهادئة تستجيب للإشارات الخارجية ، في كثير من الحالات ، لا تزال طبيعة الإشارة الخارجية غير واضحة وكذلك آلية تنشيط الخلايا الجذعية التي يسببها الإشارة. إن اكتساب فهم أفضل لكيفية استجابة الخلايا الجذعية الهادئة للإشارات الخارجية ودخولها دورة الخلية سيساعد في تطوير علاجات أفضل بالخلايا الجذعية في العيادة وزيادة المعرفة العلمية.
لعقود حتى الآن ، تم استخدام الكائنات الحية النموذجية للكشف عن الجينات ومسارات إشارات الخلايا التي تنظم تكاثر الخلايا الجذعية أثناء التطور وفي مرحلة البلوغ. في ذبابة الفاكهة ، تنقسم الخلايا الجذعية العصبية (NSCs) ، والمعروفة باسم الخلايا العصبية (NBs) ، طوال فترة التطور لتوليد جميع الخلايا العصبية والدبقية التي تتكامل في النهاية ، وتشكل الدائرة العصبية اللازمة لوظائف الدماغ 8,9. مثل الخلايا الجذعية الأخرى ، تنقسم NBs بشكل غير متماثل إلى التجديد الذاتي ، وفي بعض الحالات ، بشكل متماثل لتوسيع مجموعة الخلايا الجذعية. يتم تحديد NBs أثناء التكوين الجنيني ومعظمها يدخل في حالة هدوء نحو النهاية ، بالتزامن مع انخفاض مخازن المغذيات لدى الأمهات (الشكل 1). بعد اكتمال التكوين الجنيني ، تفقس اليرقات وتبدأ في التغذية. استجابة لتغذية الحيوانات ، تعيد NBs تنشيط من السكون وتستأنف انقسامات الخلايا10،11،12،13،14،15،16. نظرا لأن ذبابة الفاكهة CNS بسيطة نسبيا ولأن NBs تدخل وتخرج من السكون في أوقات محددة ، فإن استخدام ذبابة الفاكهة للتحقيق في تنظيم السكون والدخول والخروج ، يثبت أنه مثالي.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63189/63189fig01.jpg"> الشكل 1: الانتشار النسبي ل CB NBs (الأرومات العصبية الدماغية المركزية ، الحمراء) و MB NBs (الأرومات العصبية لجسم الفطر ، الأزرق) بمرور الوقت التنموي. في نهاية التكوين الجنيني ، تتوقف معظم NBs (الخط الأحمر) عن الانتشار وتدخل في حالة من السكون. يستمر الهدوء حتى تستهلك اليرقات الطازجة أول وجبة كاملة لها. يشار إلى نقاط التركيز الزمنية لهذه المنهجية في دوائر حمراء (1 ، هدوء و 2 ، إعادة التنشيط). MB NBs (أزرق) هي مجموعة فرعية من NBs الدماغ المركزية التي تنقسم باستمرار طوال فترة التطور (4 لكل نصف الكرة المخية). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63189/63189fig01large.jpg" target="_blank">يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>
استجابة لتغذية الحيوانات ، تصبح مسارات إشارات نمو PI3-kinase و TOR نشطة في NBs وفي مكانتها الدبقية والقصبة الهوائية10,11,15,16. عندما يتم سحب العناصر الغذائية الغذائية أو عندما يتم تقليل مستويات PI3-kinase ، تفشل NBs في إعادة تنشيط ونمو الدبقية والقصبة الهوائية يتم أيضا تقليل 10،11،15،16. يفترض النموذج الحالي أن إعادة تنشيط NB مقترنة بنمو اليرقات بواسطة الجسم الدهني ، والذي يطلق إشارة نظامية استجابة لتغذية الحيوانات12،17،18. هذه الإشارة ، التي لا تزال بعيدة المنال ، من المحتمل أن تعزز التعبير عن الببتيد الشبيه بالأنسولين (Dilps) وإطلاقه في الدماغ ، مما يؤدي إلى تنشيط PI3-kinase في نهاية المطاف في NBs ومكانتها الدبقية والقصبة الهوائية. لفهم طبيعة الإشارة (الإشارات) النظامية بشكل أفضل ، طورنا طريقة لإعادة تنشيط NBs الهادئة في الدماغ المستزرع. باستخدام هذه الطريقة ، يمكن فحص إعادة تنشيط NBs في غياب إشارات نظامية حيوانية كاملة. يمكن إعادة تزويد العوامل الخارجية بوسائل الإعلام الثقافية وإعادة تنشيط NB بناء على دمج نظير الثيميدين ، EdU. باستخدام هذه الطريقة ، قررنا أن الأنسولين الخارجي المنشأ يكفي لإعادة تنشيط NBs الهادئة في الدماغ explants. وسيهدف العمل المستقبلي إلى تحديد العوامل الإضافية التي، عند إضافتها مرة أخرى، إما بشكل إيجابي أو سلبي تنظم سكون NB في عمليات زرع الدماغ.

<table><tbody><tr><td>10 وميكرو ؛ L نصائح الماصة</td><td>Denville Sci</td><td>P2102</td><td></td></tr><tr><td>1000 & micro ؛ L نصائح الماصة</td><td>Denville Sci</td><td>P2103-N</td><td></td></tr><tr><td>1000 & micro ؛ L Pipettor</td><td>Gilson</td><td>P1000</td><td></td></tr><tr><td>16٪ بارافورمالدهيد (10 × 10 مل) علوم</td> <td>المجهر الإلكتروني</td><td>2912.60.0000</td><td>تستخدم لتثبيت أدمغة اليرقات</td></tr><tr><td>20 & L ماصة</td><td>جيلسون</td><td>P20</td><td></td></tr><tr><td>200 & micro; L نصائح الماصة</td><td>Denville Sci</td><td>1158U56</td><td></td></tr><tr><td>24 بئر لوحات ثقافة متعددة الآبار</td><td>فيشر Scientific</td><td>50-197-4477</td><td></td></tr><tr><td>35 مم أطباق بتري</td><td>فيشر Scientific</td><td>08-757-100A</td><td>مكونات طبق العنب</td></tr><tr><td>4 درجة ؛ ثلاجة C</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td>توفر درجة حرارة مثالية لمدة >24 ساعة من الحضانات في محلول الأجسام المضادة</td></tr><tr><td>63x Objective</td><td>Lecia</td><td></td><td></td></tr><tr><td>الخميرة الجافة النشطة</td><td>معظم محلات السوبر ماركت</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Fisher Scientific</td><td>214010</td><td>مكونات طبق العنب</td></tr><tr><td>Click-iT EdU Cell Proliferation Kit للتصوير ، Alexa Fluor 647 صبغة</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>C10340</td><td>لتسمية الخلايا المتكاثرة</td></tr><tr><td>المجهر متحد البؤر</td><td>Leica</td><td>SP8</td><td></td></tr><tr><td>Coverslips 22 مم × 22 مم × 1 مم ، 10 عبوات من 4 أوقية</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-544-10</td><td>يتم لصق اثنين من الغطاء بشكل كبير على نهايات شريحة المجهر. هذا يخلق مساحة تسمح للأدمغة بالطفو في مضاد للتلاشي أثناء التصوير.</td></tr><tr><td>أغطية ، 22 مم × 50 مم × 1 مم</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-545E</td><td>يتم وضع الغطاء على غطاءين مربعين على شريحة المجهر لضمان عدم تحرك الدماغ في مضاد التلاشي أثناء التصوير.</td></tr><tr><td>تشريح المجهر</td><td>Zeiss</td><td>Stemi 2000</td><td></td></tr><tr><td>الإيثانول 200 دليل (100٪) ، مختبرات Decon ، زجاجة 1 جالون</td><td>Fisher Scientific</td><td>2701</td><td>تستخدم لغسل اليرقات قبل 24 ساعة في وسط زراعة</td></tr><tr><td>مصل الأبقار الجنيني (10٪) مكمل</td> <td>Sigma</td><td>F4135-100ML</td><td>لوسائط زراعة الخلايا.</td></tr><tr><td>ملقط دقيق للتشريح</td><td>أدوات العلوم الدقيقة</td><td>11295-20</td><td>Forcepts المستخدمة في التشريح. تعمل بشكل أفضل عند شحذها.</td></tr><tr><td>زجاجات الذبابة لعبور</td><td>Genessee Scientific</td><td>32-130</td> تستخدم <td>هذه الزجاجة كحاوية تسمح للذباب بوضع البيض على طبق العنب.</td></tr><tr><td>طبق تشريح الزجاج (3 آبار)</td><td>لم تعد متوفرة</td><td></td><td></td></tr><tr><td>الجلوتاثيون</td><td>سيجما</td><td>G6013</td><td>يوفر الحماية التأكسدية أثناء زراعة الخلايا.</td></tr><tr><td>مصل الماعز</td><td>Sigma</td><td>G9023- 10ML</td><td>عامل حجب</td></tr><tr><td>أطباق العنب</td><td>المصنوعة في المنزل</td><td>صنع في المنزل</td><td>عصير العنب / أطباق الاغاروز لجمع البيض الطازج</td></tr><tr><td>Image J</td><td>Imagej.net/fiji/downloads</td><td>تحميل مجاني:&nbsp; https://fiji.sc</td><td>منصة التصوير التي تستخدم لعد الخلايا وحاضنة إعادة تنشيط</td></tr><tr><td></td><td>Edu Thermo Fisher Scientific</td><td></td><td>يضمن أن درجة الحرارة والرطوبة والتعرض للضوء متماثلين تماما طوال التجربة.</td></tr><tr><td>الأنسولين</td><td>Sigma</td><td>I0516</td><td>المتغير المستقل للتجربة</td></tr> غطاء <tr><td>التدفق</td><td></td><td></td> الصفحي <td>لوسائط الثقافة</td></tr><tr><td>L-Glutamine</td><td>Sigma</td><td>G7513</td><td>يوفر الدعم أثناء زراعة الخلايا</td></tr><tr><td>Nunc 72-well Microwell Mini Rys</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-565-154</td> يتم <td>تنفيذ خطوات التلوين المناعي في هذا الدرج</td></tr><tr><td>Parafilm</td><td>يستخدم فيلم Fisher Scientific</td><td>S37440</td><td>لإغلاق الألواح من أجل منع التبخر</td></tr><tr><td>Pen-Strep</td><td>Sigma</td><td>P4458-100ml</td><td>المضادات الحيوية المستخدمة لمنع التلوث البكتيري للخلايا أثناء الزراعة.</td></tr><tr><td>عازلة الفوسفات ، الرقم الهيدروجيني 7.4</td><td>صنع في المنزل</td><td></td><td>مذيب يستخدم لغسل الأدمغة بعد خطوات التثبيت والتلوين</td></tr><tr><td>اختر</td><td>أدوات العلوم الدقيقة</td><td>10140-01</td><td>تستخدم لقطف اليرقات من صفيحة العنب</td></tr><tr><td>حمض البروبيونيك</td><td>فيشر Scientific</td><td>A-258</td><td>مكونات صفيحة</td></tr><tr><td>العنب الأرنب 405</td><td>Abcam</td><td>ab175653</td><td>الأجسام المضادة المستخدمة في التلوين</td></tr> <tr>المناعي<td>Rat 555</td><td>Abcam</td><td>ab150166</td><td>الأجسام المضادة المستخدمة في تلطيخ المناعة</td></tr><tr><td>Rb Scribble</td><td>هدية من Chris Doe</td><td></td><td>الأجسام المضادة المستخدمة في تلطيخ المناعة</td></tr><tr><td>Rt Deadpan</td><td>Abcam</td><td>ab195173</td><td>الأجسام المضادة المستخدمة في تلطيخ مناعة</td></tr><tr><td>شنايدر ثقافة 21720024 Medium</td><td>Life Tech</td><td></td><td>يحتوي على العناصر الغذائية التي تساعد الخلايا على النمو والتكاثر</td></tr><tr><td>SlowFade Diamond مضاد للتلاشي (5 × 2 مل)</td>كاشف <td>Life Tech</td><td>S36963</td><td>يوفر الحماية ضد تلاشي الفلوروفورات</td></tr><tr><td>الأوتوكلاف بالماء المعقم</td><td>Milli-Q الماء المصنوع في المنزل</td><td></td><td>مطلوب للحلول</td></tr><tr><td>السكروز</td><td>فيشر</td><td>S2-12</td><td>مكونات صفيحة العنب شرائح</td></tr><tr><td>مجهر Superfrost</td><td>فيشر Scientific</td><td>12-544-7</td><td></td></tr><tr><td>Superglue</td><td>معظم محلات السوبر ماركت</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tegosept</td><td>Genesee Scientific</td><td>20-259</td><td>مكونات طبق العنب</td></tr><tr><td>Triton-X 100</td><td>Sigma</td><td>T9284-100ML</td><td>PBT</td></tr><tr><td>Welch عصير العنب 100٪</td><td>معظم محلات السوبر ماركت</td><td></td><td>مكونات طبق العنب</td></tr></tbody></table>

إعادة تنشيط الخلايا الجذعية العصبية في ذبابة الفاكهة المستزرعة في الدماغ

Neural Stem Cell Reactivation in Cultured Drosophila Brain Explants

الخلايا الجذعية العصبية (NSCs) لديها القدرة على التكاثر والتمايز والخضوع لموت الخلايا المبرمج وحتى الدخول والخروج من السكون. يتم التحكم في العديد من هذه العمليات من خلال التفاعل المعقد بين البرامج الجينية الجوهرية NSC مع العوامل الخارجية NSC ، المحلية والنظامية. في الكائن الحي الوراثي النموذجي ، ذبابة الفاكهة الميلانوغاستر ، NSCs ، والمعروفة باسم الأرومات العصبية (NBs) ، تتحول من السكون إلى الانتشار أثناء الانتقال الجنيني إلى اليرقات. خلال هذا الوقت ، تخرج اليرقات من قشر البيض وتبدأ في الزحف ، بحثا عن العناصر الغذائية الغذائية. استجابة لتغذية الحيوانات ، ينتج الجسم الدهني ، وهو عضو غدد صماء يتمتع بسعة تخزين الدهون ، إشارة يتم إطلاقها بشكل منهجي في الهيموليمف المتداول. استجابة للإشارة المشتقة من الجسم الدهني (FBDS) ، يتم إنتاج الببتيدات الشبيهة بالأنسولين (Dilps) وإطلاقها من الخلايا العصبية الإفرازية العصبية في الدماغ والدبقية ، مما يؤدي إلى تنشيط المصب لإشارات نمو PI3-kinase في NBs ومكانتها الدبقية والقصبة الهوائية. وعلى الرغم من أن هذا هو النموذج الحالي لكيفية تحول الاستراتيجيات وخطط العمل الوطنية من السكون إلى الانتشار، فإن طبيعة الإشارة الخارجية ل FBDS لا تزال بعيدة المنال. لفهم أفضل لكيفية تنظيم الإشارات الجهازية الخارجية NB للخروج من السكون ، تم تطوير طريقة لزراعة أدمغة اليرقات المبكرة في المختبر قبل إطعام الحيوانات. باستخدام هذه الطريقة ، يمكن توفير العوامل الخارجية لوسائل الإعلام الثقافية وخروج NB من فحص السكون. وجدنا أن الأنسولين الخارجي المنشأ يكفي لإعادة تنشيط NBs من السكون في الدماغ كله explants. نظرا لأن هذه الطريقة مناسبة تماما للشاشات واسعة النطاق ، فإننا نهدف إلى تحديد إشارات خارجية إضافية تنظم هدوء NB مقابل قرارات الانتشار. نظرا لأن الجينات والمسارات التي تنظم قرارات انتشار NSC محفوظة تطوريا ، فإن نتائج هذا الفحص يمكن أن توفر نظرة ثاقبة لتحسين العلاجات التجديدية في العيادة.

تم تشريح أدمغة أوريغون آر الطازجة من النوع البري وزراعتها لمدة 24 ساعة في وسائط شنايدر المكملة (SSM) بالأنسولين. تم إصلاح الأنسجة وتلطيخها وفقا للبروتوكول. تم استخدام الأجسام المضادة الأولية التي تم إنشاؤها ضد Deadpan (Dpn) للكشف عن NBs و Scribble لتسمية أغشية الخلايا. تمت إضافة التناظرية ثيميدين 5-إيثينيل-2′-ديوكسي يوريدين (Edu) للكشف عن دخول المرحلة S وإعادة تنشيط NB. وجدنا Edu إيجابي كبير الحجم و Dpn إيجابي NBs بعد 24 ساعة في الثقافة (الشكل 6A-C). بعد ذلك...

تم إنشاء طريقة لإعادة تنشيط الخلايا الجذعية العصبية الهادئة في خلايا دماغ ذبابة الفاكهة المستزرعة . باستخدام هذه الطريقة ، يمكن فصل دور الإشارات الجهازية عن الإشارات الجوهرية للأنسجة في تنظيم هدوء الخلايا الجذعية العصبية ودخولها وخروجها.

Neural stem cells (NSCs) have the ability to proliferate, differentiate, undergo apoptosis, and even enter and exit quiescence. Many of these processes ...

لقد طورنا طريقة لإعادة تنشيط الخلايا الجذعية العصبية الهادئة في دماغ ذبابة الفاكهة المستزرعة. يمكن لهذه الطريقة توفير عوامل خارجية المنشأ لوسائط الثقافة ويمكنها فحص إعادة تنشيط الأرومة العصبية. يمكن تطوير علاجات أفضل بالخلايا الجذعية من خلال فهم أفضل لكيفية استجابة الخلايا الجذعية الهادئة للإشارات الخارجية ودخولها دورة الخلية.ستوضح الإجراء سوزان دويل ، عالمة أبحاث من مختبري. للبدء بعناية اختيار ما يقرب من 20 إلى 25 يرقات حديثة الفقس من صفيحة أجار العنب تحت المجهر تشريح. املأ طبق بتري بحوالي ملليلتر من PBS وغمر طرف الأداة الذي يحتوي على يرقات في PBS لمدة دقيقتين.بعد دقيقتين ، قم بقلب الطبق بزاوية لتجميع السائل في الأسفل ، وباستخدام فرشاة طلاء صغيرة ، قم بتنظيف اليرقات من السائل إلى أسفل طبق بتري. جمع جميع اليرقات على فرشاة الطلاء وشطف اليرقات لفترة وجيزة في 70٪ الإيثانول قبل نقلها مرة أخرى إلى طبق بتري الذي يحتوي على PBS. رش منطقة العمل وأدوات التشريح والملقط وطبقي ساعة زجاجيين مع 70٪ من الإيثانول واتركها تجف على المقعد.اصنع وسيط شنايدر الثقافي المكمل ، أو SSM ، وضعه على الجليد. ماصة واحدة ملليلتر من الوسط في كل طبق ساعة زجاجي. باستخدام ماصة صغيرة ذات طرف معقم ، انقل اليرقات الطازجة من لوحة PBS إلى SSM في أول طبق ساعة زجاجي.تشريح الأدمغة من اليرقات الموضوعة في طبق الساعة الزجاجي الثاني باستخدام SSM باستخدام ملقط تحت مجهر تشريح وضبط التكبير حسب الحاجة. استخدم ملقطا واحدا للاستيلاء على خطافات الفم ، وبالآخر ، أمسك الجسم بلطف في منتصف الطريق لأسفل واسحبه في الاتجاه المعاكس لتقسيم اليرقة إلى قطعتين. بعد تشريح 15 إلى 20 دماغا ، أضف ملليلتر واحد من SSM إلى بئر واحد من صينية زراعة معقمة من 24 بئرا.باستخدام ماصة دقيقة وطرف معقم ، انقل الأدمغة التي تم تشريحها حديثا إلى SSM ، تليها حضانة الوسائط مع الأدمغة لمدة 24 ساعة عند 25 درجة مئوية. ماصة 10 ميكرولترات من مخزون 10 ملليمولار من 5-ethynyl-2'deoxyuridine ، أو EDU ، مع 990 ميكرولتر من SSM في أنبوب طرد مركزي دقيق معقم ، امزج ، ثم ماصة ملليلتر واحد من EDU SSM في بئر واحد من صينية الثقافة المعقمة المكونة من 12 بئرا. انقل الأدمغة باستخدام ماصة دقيقة ذات طرف معقم من البئر الذي يحتوي على SSM إلى البئر الجديد الذي يحتوي على محلول EDU SSM واحتضنها لمدة ساعة واحدة عند 25 درجة مئوية.بعد ذلك ، انقل الأدمغة التي تحمل علامة EDU إلى بئر آخر في نفس صينية الثقافة التي تحتوي على ملليلتر واحد من المثبت والسماح بتثبيت الأدمغة لمدة 20 دقيقة. بعد التثبيت ، انقل الأدمغة بسرعة إلى آبار صينية صغيرة ذات 72 بئرا باستخدام ماصة دقيقة. شطف الأدمغة ثلاث مرات في 10 ميكرولترات من PBT وتكرار ثلاث غسلات لمدة 10 دقائق لكل منها ، وضمان تغطية الأدمغة دائما ببعض السوائل.ماصة 10 ميكرولتر من محلول الحجب على الأدمغة. قم بتغطية الدرج وختمه بشريط من البارافيلم حول الحافة. يوضح الشكل خلايا الخلايا العصبية الكبيرة الحجم الإيجابية EDO والميتة الإيجابية بعد 24 ساعة من الزراعة في SSM مع الأنسولين والتلطيخ.بعد 24 ساعة في وسائط شنايدر المكملة بدون أنسولين ، لم يكن لدى أدمغة أوريغون R البرية التي تم فقسها حديثا خلايا انفجار عصبي كبيرة الحجم إيجابية EDO وإيجابية ميتة ، بخلاف خلايا الأرومة العصبية المكونة من أربعة فطر في الجسم وخلية واحدة من الخلايا العصبية البطنية الجانبية. أثناء التصوير البؤري ، لوحظت أحيانا بعض نصفي الكرة المخية مع تلف ، مثل الثقوب الصغيرة إلى الكبيرة الحجم في أنسجة المخ المزروعة. لم يتم استخدام أي أدمغة بها ثقوب للتحليل.تشريح الأنسجة بعناية وماصة بلطف لتجنب أي تلف في الأنسجة. حاول أيضا أن تكون معقما قدر الإمكان ولا تلوث ثقافاتك. نظرا لأنه يمكن التلاعب بالوسائط الثقافية بسهولة عن طريق إضافة عوامل مختلفة ، يمكن استخدام هذه التقنية لمعالجة الفرضيات المستقبلية المتعلقة بالإشارات الخارجية ودخول وخروج السكون العصبي.

neural-stem-cell-reactivation-in-cultured-drosophila-brain-explants

Research

JoVE Journal

Neuroscience

علم الأعصاب

هذا الفيديو يوضح إعداد الثقافات العصبية الأولية من العقول في وقت متأخر من مرحلة الشرانق ذبابة الفاكهة. آراء الثقافات الحية تظهر ثمرة neurite والتصوير باستخدام مستويات الكالسيوم Fura - 2.

متعلق بالخلايا العصبية الثقافات الأساسي من الأمخاخ في وقت متأخر من المرحلة ذبابة الفاكهة شرانق

هذا الفيديو يوضح إعداد الثقافات العصبية الأولية من أجنة ذبابة الفاكهة midgastrula المرحلة. آراء الثقافات الحية تظهر الخلايا 1 بعد ساعة من الطلاء ، والخلايا العصبية متباينة بعد 2 أيام من النمو في وسط بيكربونات المستندة إلى المعرفة. والخلايا العصبية كهربائيا منفعل وشكل اتصالات متشابك.

التحضير للثقافات متعلق بالخلايا العصبية من أجنة ذبابة الفاكهة المرحلة Midgastrula

وصف هذه المقالة على الطريقة التي يمكن لأحد أن...

السابقين التثقيف المجراة من الجامعة، تطوير الأمخاخ ذبابة الفاكهة

يوضح هذا الفيديو بروتوكولا لتحديد العوامل الخارجية التي تبدأ في إعادة تنشيط ذبابة الفاكهة الخلايا الجذعية العصبية للدماغ من حالتها الهادئة. يتم تشريح اليرقات الحديثة الفقس لعزل أدمغتها ، والتي يتم زراعتها بعد ذلك في وسائط مع أو بدون هرمون اختبار لتقييم قدرة الهرمون على تحفيز إعادة تنشيط الخلايا الجذعية العصبية وتكاثرها.

تحليل إعادة تنشيط الخلايا الجذعية العصبية في مستخلصات ذبابة الفاكهة المزروعة للدماغ

ويوصف نموذج باستخدام اليرقات إصابة الحبل العصبي البطني ذبابة الفاكهة للتحقيق المركزية تجديد الجهاز العصبي والإصلاح. طعن تليها الليزر المجهر متحد البؤر في الوقت الفاصل بين العينات والثابتة، بالإضافة إلى التحليل الكمي مع البرمجيات المتقدمة هادف وعلم الوراثة، وتستخدم للتحقيق في الآليات الجزيئية للتجديد وإصلاح CNS.

والنموذج الإصابات المعنية بالتحقيق في وسط الجهاز العصبي في إصلاح<em&gt; ذبابة الفاكهة</em

هذا البروتوكول تفاصيل طريقة مبسطة تستخدم لإجراء التصوير الخلية الحية في سياق الدماغ اليرقات سليمة. النهج التصوير الخلية الحية لا تقدر بثمن لدراسة الخلايا الجذعية العصبية الانقسامات غير المتماثلة فضلا عن العمليات العصبية والتنموية الأخرى، كشف باستمرار الآليات التي تم تجاهلها سابقا.

التصوير المباشر ل<em&gt; ذبابة الفاكهة</em&gt; اليرقات Neuroblasts

الظهارية إلى الانتقال اللحمة المتوسطة (EMT) تسمح للسرطانات بأن تصبح غازية. للتحقيق في EMT ، يتم وصف نموذج مختبري قائم على الخلايا الجذعية العصبية (NSC) خال من المصل والإنزيمات. يسمح هذا النظام الموحد بالتقييم الكمي والنوعي لهجرة الخلايا والتعبير الجيني والبروتيني. النموذج مناسب لاكتشاف الأدوية.

نموذج الانزيمات والمصل خالية من العصبية الثقافة الخلايا الجذعية لEMT التحقيق مناسبة للاكتشاف المخدرات

والهدف من هذا البروتوكول إنشاء ثقافة الدماغ اليرقات السابقين فيفو المورفولوجية الأمثل لرصد إيقاعات الجزيئية الإيقاعية مع المدى الطويل fluorescence الوقت الفاصل بين التصوير. وتناقش أيضا تطبيق هذا الأسلوب لفحوصات الدوائية.

Fluorescence القرار خلية واحدة تعيش تصوير ساعات الإيقاعية المورفولوجية في الدماغ اليرقات الثقافة

نقدم هنا، بروتوكول باستخدام المورفولوجية الحسية العصبية-نموذج الإصابة العصبية الجذعية أربوريزاتيون (دا)، الذي يجمع في فيفو يعيش التصوير واثنين-فوتون الليزر أكسوتومي/ديندريوتومي والأدوات الوراثية يطير قوية، منصة لفحص المروجين ومثبطات نيوروريجينيريشن المحتملة.

نموذج إصابة المورفولوجية في فيفو لدراسة نيوروريجينيريشن في الطرفية والجهاز العصبي المركزي

توفر هذه المقالة بروتوكولات مفصلة لإلحاق اختراق إصابات الدماغ الرضية (PTBI) للبالغين Drosophila وفحص التكوين العصبي الناتج.

تحفيز وتحليل تكوين الأعصاب للبالغين في الدماغ المركزي Drosophila

هنا ، نناقش سير العمل لإعداد وتشريح وتركيب وتصوير أدمغة الزرع الحية من يرقات ذبابة الفاكهة الميلانوجاستر الثالثة لمراقبة الديناميكيات الخلوية ودون الخلوية في ظل الظروف الفسيولوجية.

تصوير الخلايا الحية لذبابة الفاكهة الميلانوجاستر أدمغة اليرقات الثالثة

تعلم طريقة إعادة تنشيط الخلايا الجذعية العصبية الكامنة في شرائح دماغ Drosophila المستزرعة. تساعد هذه التقنية الباحثين على دراسة آليات الخمول والتنشيط لتحسين علاجات الخلايا الجذعية.

إعادة تنشيط الخلايا الجذعية العصبية في ذبابة الفاكهة المستزرعة في الدماغ

استكشف المزيد من الفيديوهات