تخليق ماساريميسين ، وهو مثبط جزيء صغير للنمو البكتيري الإيجابي الجرام

Masarimycin هو واحد من المثبطات القليلة لل autolysins البكتيرية التي توقف نمو الخلايا البكتيرية. يمكن استخدامه للتحقيق في الاختلافات بين التعطيل الكيميائي والجيني لل autolysins ، ويوفر نهجا متعامدا لعلم الوراثة لدراسة فسيولوجيا البكتيريا. قد يبدو تخليق ماساريميسين شاقا.

اتبع الخطوات الموضحة عن كثب. عندما تكون في شك إذا نجحت خطوة التفاعل ، تأكد من خلال كروماتوغرافيا الطبقة الرقيقة والتغيرات في قيم RF. للبدء ، قم بإعداد محلول مولاري 0.1 من سيكلوهيكسيلامين ، وكربوكسالدهيد سيكلوهيكسيل ، وحمض أورثو يودوبنزويك ، وسيكلوهكسيل إيزوسيانيد في الميثانول.

أضف شريط التحريك المغناطيسي ، ثم امزج خمسة ملليلتر من السيكلوهيكسيلامين وخمسة ملليلتر من كربوكسالدهيد السيكلوهيكسيل في قارورة مستديرة القاع مغطاة وضع القارورة في حمام رملي على مقلب صفيحة ساخنة لمدة 30 دقيقة عند 40 درجة مئوية. راقب درجة الحرارة باستخدام ميزان حرارة يوضع تحت سطح الرمال حوالي سنتيمتر واحد. بعد 30 دقيقة ، أضف خمسة ملليلتر من إيزوسيانيد السيكلوهيكسيل إلى المحلول وحرك لمدة 20 دقيقة إضافية عند 50 درجة مئوية.

ثم ، أضف خمسة ملليلترات من حمض أورثو يودوبنزويك إلى خليط التفاعل واستمر في التحريك عند 55 درجة مئوية لمدة ثلاث إلى خمس ساعات. بعد ثلاث ساعات من التحريك ، راقب تقدم التفاعل بشكل دوري بواسطة كروماتوغرافيا الطبقة الرقيقة ، أو TLC ، على فترات زمنية مدتها ساعة واحدة تقريبا. ضع في اعتبارك أن التفاعل يكتمل عندما تكون بقعة واحدة فقط ذات عامل احتفاظ يساوي 0.3 مرئية على لوحة TLC.

قم بإزالة المذيب في المبخر الدوار تحت ضغط منخفض. بمجرد تبخر كل الميثانول ، قم بإذابة المنتج الخام المجفف في 30 ملليلتر من خلات الإيثيل ونقله إلى قمع منفصل. استخراج خلات الإيثيل بالتتابع مع حمض الهيدروكلوريك المولي واحد ، والماء ، ومحلول بيكربونات الصوديوم المشبع ، والماء مرة أخرى ، ومحلول كلوريد الصوديوم المشبع ، مع التخلص من الطبقات المائية في كل استخراج.

ثم ، قم بإزالة طبقة خلات الإيثيل من القمع الفاصل وجمعها في قارورة Erlenmeyer. أضف ملعقة مليئة بكبريتات الصوديوم اللامائية لإزالة الماء المتبقي من خلات الإيثيل. قم بتصفية محلول خلات الإيثيل المجفف من خلال ورقة ترشيح رقم واحد لإزالة كبريتات الصوديوم.

ثم اغسل ورق الترشيح بكمية صغيرة من خلات الإيثيل. تم تبخر محلول خلات الإيثيل المصفى حتى يجف على مبخر دوار تحت ضغط منخفض للحصول على ماساريميسين كزيت بمجرد إزالة جميع خلات الإيثيل. يذوب زيت ماساريميسين في ملليلتر إلى ملليلتر من محلول هيكسان 9: 1 إلى إيزوبروبانول ويحرك على صفيحة تحريك مغناطيسية حتى يذوب المركب بأكمله.

لتنقية ماساريميسين المذاب ، قم بإجراء كروماتوغرافيا فلاش مع عمود فلاش سيليكا بوزن 12 جراما ، عادي الطور. قم بموازنة عمود الفلاش مع 10 أحجام أعمدة من المرحلة المتنقلة مع ضبط الأدوات بمعدل تدفق يبلغ 15 ملليلتر في الدقيقة. بعد اكتمال التوازن ، ارسم الماساريميسين المذاب باستخدام حقنة سعة خمسة ملليلتر.

قم بتوصيل المحقنة مباشرة بالجزء العلوي من عمود الفلاش المتوازن وحقن المحلول في العمود. أعد توصيل العمود الذي تم تحميله بنظام كروماتوغرافيا الفلاش وابدأ إزالة التدرج. إلوت ماساريميسين من العمود باستخدام إزالة التدرج إلى تركيز المرحلة المتنقلة النهائي من 10:90 الهكسان إلى الأيزوبروبانول على 12 حجم عمود.

راقب إزالة الماساريميسين عن طريق الامتصاص عند 230 و 254 نانومتر. بالنسبة لدراسة المورفولوجيا ، تنمو عصية subtilis 11774 على ألواح أجار LB عند 37 درجة مئوية. في جميع التجارب اللاحقة ، استخدم خلايا الممر الثاني المزروعة في خمسة ملليلترات من مرق LB حتى تصل الكثافة البصرية عند 600 نانومتر إلى 1.

بعد ذلك ، باستخدام ماصة ، أضف ماساريميسين إلى أنابيب الاستزراع المصنفة المعالجة بتركيز نهائي من 3.8 ميكرومولات. بالنسبة لأنابيب الاستزراع المسماة بالتحكم، أضف حجما مكافئا من DMSO. ضع العينات في حاضنة عند 37 درجة مئوية لمدة 90 دقيقة مع الاهتزاز عند 150 دورة في الدقيقة.

بعد 90 دقيقة ، قم بإصلاح الثقافات كيميائيا في مزيج 1:10 من وسائط الثقافة وتثبيت المخزن المؤقت عند أربع درجات مئوية بين عشية وضحاها. في اليوم التالي ، استخدم ماصة لتطبيق 10 إلى 20 ميكرولتر من العينات الثابتة كيميائيا على شرائح المجهر الزجاجية والسماح لها بالجفاف في الهواء. بعد ذلك ، قم بإصلاح العينات المجففة بالهواء عن طريق تسخين الشرائح الزجاجية باستخدام موقد Bunsen.

بعد تثبيت الحرارة ، قم بتلطيخ العينات ب 100 ميكرولتر من 0.1٪ من أزرق الميثيلين. بعد حضانة لمدة 10 دقائق مع البقعة ، اغسل الصبغة الزائدة بالماء المقطر. ثم ، سخني الشرائح الملطخة بلطف إلى 60 درجة مئوية في فرن لمدة 15 إلى 20 دقيقة لإحضار الخلايا إلى مستوى بؤري مشترك.

ختم العينات الملطخة عن طريق وضع غطاء المجهر الانزلاق فوق الخلايا الملطخة. ثم ، قم بإغلاق الحواف باستخدام أسمنت شريحة المجهر. ضع شريحة المجهر المختومة على مرحلة المجهر واجعل الصورة في بؤرة التركيز عند تكبير 100X باستخدام المجهر الساطع المجال.

ضع قطرة من زيت الغمر على شريحة المجهر واجعل مجال الرؤية يركز باستخدام التكبير 1000X. الحصول على الصور المجهرية باستخدام كاميرا متصلة بالمجهر والبرامج المرتبطة به. احصل على صور باستخدام إعدادات توازن اللون الأبيض التلقائي وفتحة العدسة الخاصة بالبرنامج.

كروماتوغرافيا فلاش يسمح لتنقية سريعة من masarimycin مع نقاء عالية. يتم عرض تقييم التآزر أو العداء مع مثبط ATPase optochin في S.pneumoniae هنا. يعتبر أدنى تركيز للمركب لتثبيط نمو البكتيريا ، المشار إليه باللون الأزرق ، الحد الأدنى لقيمة التركيز المثبطة في وجود دواء مشترك.

في المقابل ، تشير الآبار ذات اللون الوردي إلى نمو البكتيريا. أظهرت اختبارات النمط الظاهري باستخدام ماساريميسين عند 0.75 ضعف الحد الأدنى من التركيزات المثبطة نمطا ظاهريا يشبه النقانق ل B.subtilis ونمطا ظاهريا متكتلا ل S.pneumoniae. انتبه إلى درجة حرارة التفاعل.

تأكد من اكتمال التفاعل عن طريق المراقبة باستخدام TLC. يمكن استخدام هذه الطريقة بالاقتران مع المضادات الحيوية ذات العلامات الفلورية للتحقيق في التغييرات التي تطرأ على جدار الخلية عن طريق الفحص المجهري.