تصوير بؤري عالي الإنتاجية لمشمشات سبايك SARS-CoV-2 ذات النقاط الكمومية لتتبع الارتباط وكثرة الخلايا الداخلية في خلايا HEK293T
أبريل 21, 2022
في هذا البروتوكول ، تمكن النقاط الكمومية المترافقة مع ارتفاع SARS-CoV-2 المؤتلف من الفحوصات القائمة على الخلايا من مراقبة ارتباط السنبلة إلى hACE2 في غشاء البلازما وكثرة الخلايا الداخلية اللاحقة للبروتينات المرتبطة في السيتوبلازم.
لقد أنشأنا تقنية منصة ل SARS COVID 2 يمكن تطبيقها على الفيروسات الأخرى مع التعرف على الخلايا بوساطة Spike ودخولها كخطوة أولى في العدوى الفيروسية الخلوية. النقاط الكمومية مشرقة ومستقرة ويمكن تشغيل سطحها لمجموعة متنوعة من التطبيقات الخلوية. باستخدام هذه الطريقة ، يمكننا تصور وقياس استيعاب Spike في الخلايا.
لإعداد 0.1٪ BSA. أضف 130 ميكرولتر من 7.5٪ BSA إلى 10 ملليلتر من وسائط التصوير في مزيج. للحصول على تخفيف تسلسلي من 6.1 إلى ثلاثة وثلاثة أضعاف ، أضف 14.26 ميكرولتر من QD Spike إلى 285.74 ميكرولتر من 0.1٪ BSA لجعل أعلى تركيز من 20 نانومول.
ثم أضف 100 ميكرولتر من 20 نانومول أو QD Spike إلى 200 ميكرولتر من 0.1٪ BSA لجعل الوهم الثاني من 6.67 نانومول QD Spike. قم بإزالة جميع الوسائط المستهلكة من كل بئر باستخدام شفاط متعدد القنوات ، واغسلها مرة واحدة باستخدام ماصة متعددة القنوات مع 100 ميكرولتر من وسائط التصوير لكل بئر ، ثم استطلع 100 ميكرولتر من وسائط التصوير. أضف 50 ميكرولتر من محلول QD Spike لكل بئر واحتضن الطبق لمدة ثلاث ساعات في حاضنة رطبة عند 37 درجة مئوية مع 5٪ من ثاني أكسيد الكربون.
ارتداء معدات الحماية ، وإعداد 4 ٪ PFA و 0.1 ٪ PSA وسائط التصوير داخل خزانة السلامة الحيوية المعقمة ، وشفط 50 ميكرولتر من QD Spike من كل بئر وإضافة 100 ميكرولتر من 4 ٪ PFA لكل بئر مع ماصة آلية متعددة القنوات لتجنب تجفيف الآبار. احتضن لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة ، ثم اغسل ثلاث مرات باستخدام PBS ، وقم بإعداد الصبغة النووية الحمراء العميقة عن طريق تخفيف محلول مخزون الخمسة ملليمترات عند واحد إلى 1000 في PBS ، وشفط PBS وإضافة 50 ميكرولتر من الصبغة النووية المخففة لكل بئر. احتضن لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة ثم اغسلها ثلاث مرات باستخدام PBS ، أو صور اللوحة أو أغلقها باستخدام مانع تسرب اللوحة للتصوير لاحقا.
قم بتخزين اللوحة عند أربع درجات مئوية. بدء تشغيل البرنامج الخاص بمنصة التصوير. بعد تسجيل الدخول إلى منصة التصوير ، قم بإنشاء بروتوكول اكتساب جديد عن طريق تحديد نوع اللوحة كلوحة تصوير سفلية شفافة من 96 جدارا ، وحدد الوضع البصري وأصبح محوريا وتكبيره مثل غمر الماء 40 مرة ، وحدد binning كواحد.
حدد وضع تباينات الوجه الرقمي مثل التباين العالي لإنتاج أجسام خلايا محددة جيدا. التقط لقطة للتأكد من أن هذا العنوان مناسب كما هو موضح في نافذة الصورة، وحدد قناة C المناسبة للاستخدام مع خط خلية ACE2-GFP لتصور تهريب ACE2 داخل الخلية. لإنشاء قناة QD مخصصة ، حدد القائمة المنسدلة للمثلث واختر الإثارة في نطاق 405 نانومتر في الانبعاثات في نطاق 608 نانومتر ، وحدد بئرا بإشارة QD سيتوبلازمية قوية لضبط وقت التعرض وقوة الليزر وموضع ارتفاع Z.
تحقق مما إذا كان الارتفاع الافتراضي ينتج صورة للخلايا في المستوى البؤري المطلوب. سيكون موضع Z أقل بالنسبة للبونكتا الداخلية من موضع Z لغشاء البلازما. اختر وقت التعرض ، عادة ما بين 100 و 300 مللي ثانية ينتج صورة ساطعة بمستويات رمادية ، أكبر بثلاثة أضعاف على الأقل من إشارة الخلفية.
عند 20 نانومول ، يجب أن تكون المستويات الرمادية حوالي 6000 وحدة ذرية مع وقت تعرض 200 مللي ثانية وقوة ليزر 80٪. تحقق من المستويات الرمادية من خلال النقر بزر الماوس الأيمن على الصورة المنتجة باستخدام ميزة اللقطة في كل قناة وتحديد كثافة العرض ، ثم انقر بزر الماوس الأيسر على الكائن محل الاهتمام أو الخلفية لعرض المستوى الرمادي لهذا البكسل ، واضبط طاقة الليزر لضبط شدة الكائنات ذات الاهتمام. احفظ بروتوكول الاكتساب ، وقم بالتبديل لتشغيل التجربة وأدخل اسم اللوحة ، وقم بتشغيل التجربة.
تم تصور نقل كل من QDs و ACE2 باستخدام المجهر الفلوري وخط الخلية ACE2-GFP. تم إجراء تجزئة الصور والتحليل اللاحق لاستخراج المعلمات ذات الصلة مثل عدد النقاط. أولا ، تم تقسيم النوى من قناة العلامة النووية لإنشاء مجموعة عائد على الاستثمار.
ثم منطقة عائد استثمار تحدد الخلية مع تقسيم باستخدام قناة ACE2-GFP. وأخيرا، تم تقسيم بقع QD 608 Spike من منطقة عائد الاستثمار الخلوي، وأظهرت إشارات QD و ACE2 الداخلية توطينا مشتركا قويا. تم إجراء تجربة استجابة التركيز مع ستة تركيزات مختلفة من QD Spike في خلايا HEK 293T.
لتحديد التركيزات البصرية ل QD ، يمكن استخدام QDS منخفضة تصل إلى 2.22 نانومول ، ومع ذلك ، فمن المستحسن استخدام تركيزات 10 نانومول أو أعلى لضمان استجابة قوية. أثناء الاقتران إلى تجميع بروتين QD قد يحدث. تم رصد المجاميع في محلول QD كراسبات متكتلة ساطعة وخلايا HEK 293T ، تم احتضان QDs بأجسام مضادة محايدة تبدأ من 30 ميكروغرام لكل ميكرولتر قبل إضافتها إلى الخلايا ، هذه الأجسام المضادة منعت الاستيعاب الداخلي وتسببت في انخفاض في عدد البقع مقارنة بالخلايا المعالجة ب QD فقط.
يمكن أيضا استخدام هذا المقال للفحص عالي الإنتاجية ، والتقييم الرئيسي للأجسام المضادة المحايدة لتحديد مضادات الفيروسات التورية إلى دخول الفيروس الكتلي وتكييفها لدراسة المتغيرات الناشئة حديثا.
اعرض النص الكامل واحصل على الوصول إلى آلاف الفيديوهات العلمية
نظرة عامة
تقدم هذه الدراسة تقنية منصية تستخدم النقاط الكمومية المقترنة ببروتينات spike لفيروس SARS-CoV-2 لتصوير وقياس ارتباط بروتين spike بمستقبل hACE2 على أغشية الخلايا، بالإضافة إلى عملية الإدخال الخلوي اللاحقة لهذه البروتينات إلى السيتوبلازم. توفر هذه الطريقة رؤى حول الخطوات الأولية للعدوى الفيروسية الخلوية، وتتيح إمكانية تطبيق واسعة على فيروسات أخرى تعتمد في دخولها على بروتينات spike.
مكونات الدراسة الرئيسية
مجال البحث
- بيولوجيا الخلية
- البيولوجيا الجزيئية
- الإمراض الفيروسي
الخلفية العلمية
- يتفاعل SARS-CoV-2 مع hACE2 للدخول إلى الخلية، وهي خطوة حاسمة في العدوى الفيروسية.
- توفر النقاط الكمومية وسيلة مستقرة وفعالة لتتبع العمليات البيولوجية.
- يمكن لفهم استيعاب البروتين الشوكي داخلياً أن يساهم في تطوير مضادات الفيروسات.
الطرق المستخدمة
- المجهر الفلوري لتصوير العمليات الخلوية.
- خلايا HEK 293T كنموذج بيولوجي للتجربة.
- تجارب الاستجابة للتركيز لتحسين استخدام النقاط الكمومية.
النتائج الرئيسية
- التصوير الناجح لعملية استيعاب بروتين spike وتوضعه المشترك مع ACE2.
- تحديد تركيزات النقاط الكمومية المثلى لضمان الحصول على نتائج موثوقة.
- إثبات القدرة على تقييم تأثير الأجسام المضادة المعادلة على دخول الفيروس.
الاستنتاجات
- تقدم هذه الدراسة منهجية جديدة لتتبع آليات دخول الفيروسات.
- يمكن أن يؤدي هذا النهج إلى تطورات محتملة في عمليات فحص مضادات الفيروسات وتطوير العلاجات.
الأسئلة الشائعة
الأهمية الصناعية التنفيذية
تتيح هذه الطريقة التصوير عالي الإنتاجية لارتباط بروتين السنبلة (spike protein) الفيروسي وعملية الالتقام الخلوي، مما يدعم التحقق من أهداف مضادات الفيروسات في المراحل المبكرة. ومن خلال قياس التفاعلات بين المستقبل والربيطة وعمليات النقل في سياق خلوي ذي صلة فسيولوجياً، توفر هذه الطريقة تقليلاً للمخاطر الميكانيكية فيما يتعلق بمثبطات الدخول. كما تدعم المنصة الفحص القابل للتوسع للأجسام المضادة المُحيدة والمركبات الرائدة ضد SARS-CoV-2 والفيروسات الأخرى التي تعتمد في دخولها على بروتين السنبلة.
التطبيقات الاستراتيجية في البحث والتطوير في مجال الأدوية البيولوجية
الاكتشاف المبكر والتحقق من الهدف
- القيمة العلمية: يتيح الملاحظة المباشرة لارتباط بروتين spike بـ hACE2 وما يتبع ذلك من إدخال خلوي، مما يثبت صحة آلية دخول الفيروس كهدف علاجي.
- القيمة التشغيلية: يستخدم مترافقات النقاط الكمومية كمجسات فلورية مستقرة لتتبع ديناميكيات spike بنسبة إشارة إلى ضجيج عالية، مما يقلل من النتائج السلبية الكاذبة في مقايسات الارتباط.
- القيمة التنبؤية: تدعم بيانات الاستجابة للتركيز (على سبيل المثال، الإشارات الفعالة عند ≥10 nanomole QD Spike) نمذجة مشاركة الهدف المعتمدة على الجرعة لتحسين المركبات الرائدة.
الفحص وتطوير المقايسة
- القيمة العلمية: يتيح تقسيم النوى، والخلايا التي تعبر عن ACE2-GFP، وبقع QD Spike إجراء تحليل كمي لعدد البقع من أجل الفحص عالي المحتوى لمثبطات الارتباط والاستيعاب الخلوي.
- القيمة التشغيلية: يتضمن البروتوكول خطوات مؤتمتة للتثبيت، وصبغ النوى، والتصوير متوافقة مع تنسيقات الأطباق ذات 96 بئراً، مما يدعم توحيد المقايسات وقابليتها للتكرار.
- القابلية للتوسع: يشير الاستخدام المثبت في تجارب الاستجابة للتركيز بستة تركيزات وتخفيفات ثلاثية إلى الجاهزية لحملات الفحص ذات الإنتاجية المتوسطة إلى العالية.
الأبحاث الانتقالية وما قبل السريرية
- القيمة التطبيقية: يوفر التموضع المشترك لبروتين Spike المسمى بـ QD والمستدخل مع ACE2-GFP قراءة ميكانيكية لتقييم الأجسام المضادة المحيدة التي تمنع دخول الفيروس، مما يوجه بشكل مباشر عملية تقييم المركبات الرائدة.
- الاستمرارية قبل السريرية: تدعم القدرة على اختبار فعالية الأجسام المضادة (على سبيل المثال، تقليل عدد البقع باستخدام أجسام مضادة محيدة بتركيز 30 μg/μL) قرارات التقدم المدروسة بناءً على المخاطر في تطوير مضادات الفيروسات.
- القابلية للتكيف: يمكن تطبيق هذه المنصة على المتحورات الناشئة والفيروسات الأخرى التي تتوسط عملية دخولها بروتينات spike، مما يعزز الفائدة طويلة المدى في برامج التأهب للأوبئة.
تكامل مسار العمل والتدفق الإجرائي
تندرج هذه الطريقة ضمن تسلسل عمليات اكتشاف مضادات الفيروسات، بدءاً من التحقق من الهدف، مروراً بتحديد المركبات الرائدة، وصولاً إلى التقييم قبل السريري، مما يتيح التقييم التكراري للمركبات التي تستهدف بروتين spike.
- بيولوجيا الاكتشاف: يدعم اختبار الفرضيات المتعلقة بالتفاعل بين بروتين spike ومستقبل hACE2 ومسارات الالتقام الخلوي، مما يوضح آلية عمل مثبطات الدخول.
- الفحص: يولد قراءات تصويرية كمية (عدد البقع، والتوضع المشترك) تتيح مقارنة موثوقة لتأثيرات المركبات على الارتباط الفيروسي والاندماج الداخلي.
- التحليلات: يستخلص مقاييس عدد البقع وكثافتها من القنوات المجزأة، مما يوفر مدخلات إحصائية لتحديد الاستجابة للجرعة وتوصيف التثبيط.
- الأبحاث الانتقالية: يربط بيانات الارتباط والاندماج الداخلي بالنتائج الوظيفية (على سبيل المثال، تقليل دخول بروتين spike بوساطة الأجسام المضادة)، مما يدعم قرارات المضي قدماً أو التوقف عن البحث.
- إعادة الاستخدام المؤسسي: تم تصميم البروتوكول لإعادة الاستخدامه عبر أهداف وخطوط خلوية مختلفة، مع إمكانية تكييف اقتران النقاط الكمومية مع ربيطات أو مستقبلات أخرى.
التأثير التشغيلي والمؤسسي
- القيمة العلمية: توفر تصوراً مباشراً لآليات دخول الفيروس، مما يقلل من الغموض الميكانيكي في التحقق من صحة الهدف.
- القيمة التشغيلية: تتيح استقرار وسطوع النقاط الكمومية (Quantum dot) اكتشافاً متسقاً للإشارة عبر جميع التجارب، مما يحسن من إمكانية تكرار المقايسة.
- القيمة الاستراتيجية: تتيح التحديد المبكر لمثبطات الدخول الفعالة، مما يقلل من مخاطر الفشل في المراحل المتأخرة بسبب عدم الارتباط بالهدف.
- التأثير على المحفظة: تدعم تحديد أولويات المركبات الرائدة بناءً على بيانات كمية حول تثبيط الاستيعاب الداخلي، مما يحسن كفاءة رأس المال في برامج مضادات الفيروسات.
اعتبارات التنفيذ
- يتطلب خبرة في المجهر الفلوري، والتعامل مع النقاط الكمومية، وتحليل تقسيم الصور.
- يعتمد على أنظمة التصوير الفلوري بؤرية المسافة (confocal) أو ذات المجال الواسع مع مرشحات إثارة/انبعاث قابلة للضبط (على سبيل المثال، إثارة عند 405 nm وانبعاث عند 608 nm لـ QD608).
- يتطلب توحيد المعايير بين الفرق فيما يخص تخفيف الأجسام المضادة، وأوقات الحضن، وخطوات الغسيل لتقليل التباين في قراءات عدد البقع.
- يجب مراعاة تجمع النقاط الكمومية أثناء عملية الاقتران، مما يتطلب تصفية المحلول (على سبيل المثال، عبر الطرد المركزي أو الترشيح) قبل الاستخدام.
- قد يتطلب التكييف مع أنظمة غير HEK293T تحسين تعبير ACE2 أو استخدام وسم مستقبل بديل لدراسات التوضع المشترك.
![[كنفوكل] مجهرية يكشف خلية مستقبلات سطح التجميع عن طريق التحليل الطيفي ارتباط الصورة](/_next/image?url=https%3A%2F%2Fcloudfront.jove.com%2FCDNSource%2Fteasers%2F57164.jpg%3Fv%3D2026-08-11T08%253A27%253A19.639Z&w=384&q=75)
