توليد الطفرات الخالية لتوضيح دور الجليكوسيل ترانسفيراز البكتيري في الحركة البكتيرية

لذلك مشتق حمض العصبيات موجود فقط في البكتيريا المسببة للأمراض ، يحتوي السوط aminiglycosylated على هذا السكر. في إطار حذف المنطقة الموجودة في الجينات يمكن أن يساعد في العثور على مجموعات غليكوزيل السوط. هذه التقنية ، أحدث منطقة أو جينات محددة ، مثل glycosyltransferases التي لديها تماثل عال بينها وتشارك في عمليات مختلفة ، وتحليل مشاركتها في عملية غليكوزيل السوط.

يمكن أن تساعد هذه التقنية أيضا في العثور على دور الجليكوسيل ترانسفيراز المشاركة في التخليق الحيوي لالسكريات ذات الصلة في البكتيريا المسببة للأمراض وكذلك دور بروتينات ترميز الجينات المشاركة في تكوين السوط. عرض الإجراء سوف مايت بولو ، فني في مختبري. صمم زوجين من الاشعال التي تضخم مناطق الحمض النووي في المنبع والمصب من الجين أو المنطقة المحددة المراد حذفها.

يجب أن يتضمن التمهيديان A و D في النهاية الخمسة الرئيسية موقعا مقيدا ل endonuclease يسمح بالاستنساخ في pDM4. تأكد من أن الاشعال B و C داخل الجين المراد حذفه أو داخل الجين الأول والأخير من المنطقة المراد حذفه. تأكد من أن كلا الاشعال في الإطار ويقع بين خمسة إلى ستة كودونات داخل الجين.

تأكد من أن كلا التمهيديين يشملان تسلسلا مجانيا ل 21 زوجا أساسيا في الطرف الرئيسي الخمسة للانضمام إلى أمبليونات الحمض النووي AB و CD.استخدم 100 نانوغرام من الحمض النووي الكروموسومي النقي كقالب في مجموعتين من PCRs غير المتماثلة مع الاشعال AB و CD متبوعا بتحليل المنتجات الناتجة في هلام الأغاروز 1٪. تنقية وقياس كمية الأمبليونات المستثناة من الجل الكهربائي الرحلان. امزج 100 نانوغرام من كل أمبليكون مع كواشف PCR بدون برايمر.

بعد توسيعه ، أضف الاشعال A و D وقم بتضخيمها كجزء واحد. بعد ذلك تحليل وتنقية وقياس المنتجات الناتجة كما هو موضح سابقا. هضم ميكروغرام واحد من pDM4 و 400 نانوغرام من أمبليكون AD مع endonuclease.

اجمع pDM4 المهضوم مع أمبليكون AD عند متجه مولي لإدخال نسبة من واحد إلى أربعة وإعداد تفاعل الربط. احتضان بين عشية وضحاها في 20 درجة مئوية. في وقت لاحق ، قم بتعطيل T4 ligase عند 70 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة.

تلقيح سلالة الإشريكية القولونية في مرق لوريا بيرتاني ميلر وتحضن عند 30 درجة مئوية مع اهتزاز عند 200 دورة في الدقيقة حتى يتم ملاحظة كثافة بصرية بين 0.4 و 0.6. قم بتكبيل ثقافة البكتيريا عن طريق الطرد المركزي في 5،000 مرة G و 4 درجات مئوية لمدة 15 دقيقة. الكريات في الماء المقطر المبرد وكرر عملية التنظيف مرتين أخريين.

انقل تعليق البكتيريا إلى أنابيب الطرد الدقيق وكرر الطرد المركزي عند 14،000 مرة G وأربع درجات مئوية لمدة خمس دقائق. بعد تعليق الكريات في الماء المبرد ، أضف ما يقرب من 3.5 ميكرولتر من خليط الربط واحتضنها على الثلج لمدة خمس دقائق. انقل المحتويات إلى كوفيت كهربائي مبرد بمليمترين.

بعد الكهربية ، أضف وسط SOC وانقل محتوياته إلى أنبوب استزراع. احتضن لمدة ساعة واحدة عند 30 درجة مئوية مع الاهتزاز عند 200 دورة في الدقيقة. لوحة الخلايا المحولة على لوحات أجار LB المكملة بالكلورامفينيكول.

تحقق من إدراج بنية الحذف في pDM4 بواسطة PCR باستخدام الاشعال التي تحيط بجانب استنساخ pDM4. قم بإعداد ثقافات بين عشية وضحاها بحيث يقوم المتلقي Aeromonas بتصفية ريفامبيسين المقاومة وسلالتين مختلفتين من الإشريكية القولونية. سلالة المتبرع مع البلازميد المؤتلف pDM4 ، وسلالة المساعد مع البلازميد PRK 2073 عند 30 درجة مئوية.

نفس العدد من مستعمرات سلالات المتبرع والمتلقي والمساعد في ثلاثة أنابيب LB مع 150 ميكرولتر من LB. ثم على صفيحة أجار LB بدون مضادات حيوية ، امزج المعلقات البكتيرية الثلاثة في قطرتين عند المتلقي للمساعدة إلى نسبة المتبرع من خمسة إلى واحد إلى واحد ، واحتضن الصفيحة وجها لوجه بين عشية وضحاها عند 30 درجة مئوية. حصاد البكتيريا عن طريق إضافة ملليلتر واحد من مرق LB إلى لوحة LB agar. انقل التعليق البكتيري إلى أنبوب ميكروفوج مخروطي 1.5 ملليلتر ودوامة قوية.

انشر 100 ميكرولتر من التعليق البكتيري على ألواح LB agar مع ريفامبيسين وكلورامفينيكول. قم بتدوير 200 ميكرولتر و 600 ميكرولتر من العينات ، الكريات في 100 ميكرولتر من مرق LB ولوحة على LB agar مع ريفامبيسين وكلورامفينيكول تليها الحضانة. قم بإجراء اختبار أوكسيديز للتأكد من أن المستعمرات هي Aeromonas.

تأكد كذلك من إدخال البلازميد المؤتلف pDM4 في منطقة الكروموسومات المحددة بواسطة PCR باستخدام الاشعال E و F. تنمو المستعمرات المؤتلفة في ملليلترين من LB مع 10٪ من السكروز وبدون مضادات حيوية بين عشية وضحاها عند 30 درجة مئوية. بعد تحضير تخفيفات مختلفة للثقافة ، قم بلوحة 100 ميكرولتر من الثقافات البكتيرية والتخفيفات على لوحة LB agar مع 10٪ من السكروز واحتضنها بين عشية وضحاها عند 30 درجة مئوية.

في اليوم التالي ، التقط المستعمرات ونقلها إلى لوحات LB مع وبدون الكلورامفينيكول. بعد احتضانها بين عشية وضحاها عند 30 درجة مئوية ، حدد مستعمرات الكلورامفينيكول الحساسة. قم بتحليل المستعمرات الحساسة بواسطة PCR باستخدام زوج الاشعال EF وحدد المستعمرات التي يرتبط منتج PCR الخاص بها بحجم البنية المحذوفة.

ضع قطرة صغيرة من السيليكون في الزوايا الأربع لشريحة الغطاء وقم بتركيب ثقافة Aeromonas المزروعة بين عشية وضحاها على شريحة غطاء. ضع شريحة محفورة على شريحة الغطاء واقلب الشريحة رأسا على عقب. قم بتحليل حركية السباحة بواسطة المجهر الضوئي باستخدام المجهر البصري ، ثم انقل ثلاثة ميكرولترات من الثقافة إلى وسط صفيحة أجار ناعمة.

احتضن الصفيحة وجها لوجه بين عشية وضحاها بين 25 و 30 درجة مئوية. باستخدام مسطرة في نهاية الحضانة ، قم بقياس الهجرة البكتيرية من مركز الصفيحة نحو المحيط عبر الأجار. يجهد Aeromonas بين عشية وضحاها في 900 ملليلتر TSB بين 25 إلى 30 درجة مئوية.

بعد الطرد المركزي ، الكريات في 20 ملليلتر من 100 ملليمول من المخزن المؤقت لكلوريد الهيدروجين Tris من الرقم الهيدروجيني 7.8. لإزالة السوط المثبت، قم بمسح التعليق في دوامة بقضيب زجاجي لمدة ثلاث إلى أربع دقائق، ثم مرر بشكل متكرر عبر حقنة قياس 21. قم بتكسير البكتيريا عن طريق جهازين متتاليين للطرد المركزي عند أربع درجات مئوية وجمع المادة الفائقة في أنبوب منفصل.

بعد الطرد المركزي الفائق ، الكريات في 150 ميكرولتر من 100 ملليمولار كلوريد الهيدروجين تريس الذي يحتوي على اثنين من ملليمولار EDTA العازلة. انقل 150 ميكرولتر من الجزء المخصب من السوط إلى أنبوب رفيع الجدران فائق الوضوح ، واملأه ب 12 ملليلتر من محلول كلوريد السيزيوم. جهاز طرد مركزي فائق الأنبوب بسرعة 60،000 مرة G لمدة 48 ساعة عند أربع درجات مئوية في دوار دلو متأرجح.

اجمع شريط السوط في تدرج كلوريد السيزيوم باستخدام حقنة ودياليز ضد 100 ملليمولار كلوريد الهيدروجين Tris بالإضافة إلى ملليمولين EDTA متبوعا بتحليل بواسطة الرحلان الكهربائي و Coomassie الأزرق تلطيخ أو مطياف الكتلة. في الشكل التالي ، حارة WT هي Aeromonas piscicola AH3. تظهر الممرات من واحد إلى ثمانية مستعمرات حساسة للكلورامفينيكول لإعادة التركيب الثانية.

ST هو علامة فرط المثانة 1KB. تظهر الممرات من واحد إلى ثلاثة ومن خمسة إلى ثمانية المستعمرات ذات الجين FGI4 من النوع البري ك lane WT. يظهر Lane Four مستعمرة بها جين FGI4 المحذوف. أظهرت المقايسات المجهرية الضوئية أن تعديلات السوط القطبية أو الجانبية تؤدي فقط إلى انخفاض في أقطار الهجرة ، وبالتالي ، فإن طفرات AH-3 FGI و AH-3 FGI-4 تظهر فقط حركة منخفضة فيما يتعلق بسلالة النوع البري.

يوضح الشكل السوط القطبي من AH-3 من الحارة الأولى ، وعدم وجود طفرات في منطقة FGI من الحارة الثانية وجين FGI-4 من الحارة الثالثة ، حيث يحتوي كلا المتحورين على سوط قطبي بوزن جزيئي أقل من سلالة النوع البري ، مما يشير إلى حدوث تغييرات في السوط غليكان. من المهم التأكد من أن الطفرات لا تؤثر على الجينات النهائية وتؤدي إلى عدم القدرة على تجميع السوط أو عدم القدرة على خيوط السوط. عندما لا يمكن الكشف عن التغيير في بروتينات السوط ، يلزم تحليل مطياف الكتلة باستخدام البروتين الكلي لببتيدات السوط من أجل معرفة كتلة الجليكان.