استخدام تلطيخ أليزارين الأحمر للكشف عن فقدان العظام المستحث كيميائيا في يرقات الزرد
ديسمبر 28, 2021
هنا ، استخدمنا تلطيخ أليزارين الأحمر لإظهار أن التعرض لأسيتات الرصاص يسبب تغيرا في كتلة العظام في يرقات الزرد. يمكن تكييف طريقة التلوين هذه للتحقيق في فقدان العظام في فقدان يرقات الزرد الناجم عن المواد السامة الخطرة الأخرى.
يمكن أن تساعد هذه الطريقة في اكتشاف سمية العظام التي تسببها المواد الكيميائية في الزرد. أليزارين الأحمر يولد تلطيخ الأنسجة الثابتة سجلا دائما للتغيرات الهيكلية التي يمكن أن تسهل مقارنات عدة عينات. يمكن أن تكون هذه التقنية مفيدة لدراسة هشاشة العظام في نموذج الزرد ، لأن إحدى خصائص هشاشة العظام هي انخفاض كتلة العظام.
قم بإزالة 10 يرقات من أسماك الزرد بشكل عشوائي من كل مجموعة بعد تسعة أيام من الإخصاب ، وقم بتثبيت الأسماك في ملليلتر واحد من 2٪ ألدهيد بارافورم و 1X PBS لمدة ساعتين. صب المحلول واغسل يرقة الزرد باستخدام 100 ملليمولار تريس هيدروكلورايد مع درجة حموضة 7.5 أو 10 مليمولار كلوريد المغنيسيوم. لإزالة البقع ، صب المحلول واحتضان اليرقة لمدة خمس دقائق في سلسلة من الحلول كما هو موضح في المخطوطة.
بعد الحضانة النهائية ، صب المحلول وإزالة الصباغ عن طريق التبييض بمحلول يتكون من 3٪ بيروكسيد الهيدروجين و 0.5٪ هيدروكسيد البوتاسيوم. لاحظ مرة واحدة كل 10 دقائق حتى تتم إزالة الصباغ تماما. شطف يرقة الزرد عدة مرات مع 25 ٪ من الجليسرين ، 0.1 ٪ هيدروكسيد البوتاسيوم لمدة 10 دقائق لكل منهما حتى لا تكون هناك فقاعات.
وصمة عار في اليرقة عن طريق نقع في ملليلتر واحد من 0.01 ٪ اليزارين. صب المحلول ، وأضف ملليلتر واحد من 50٪ جليسرين أو 0.1٪ هيدروكسيد البوتاسيوم لمسح الخلفية. قم بتخزين السمك في 50٪ جليسرين طازج أو 0.1٪ هيدروكسيد البوتاسيوم للمراقبة اللاحقة.
انقل يرقة واحدة في كل مرة على الشريحة الزجاجية مع إبقاء اليرقة في منتصف قطرة السائل. مراقبة اليرقة تحت مجهر ستيريو. قم بتشغيل الكاميرا.
افتح البرنامج واحتفظ بالإعدادات الافتراضية. انقر فوق AE واختر وقت التعرض المناسب للحصول على أفضل صورة. التقط جميع الصور تحت نفس الإعدادات.
احفظ الصور بتنسيق dot tiff لتحليلها لاحقا. انقر نقرا مزدوجا فوق رمز imageJ. لتحليل الصور المحفوظة ، انقر فوق ملف ، ثم افتح ، ثم انقر فوق الصورة ، ثم اكتب وحدد ثمانية بت.
انقر فوق تحرير ، وعكس. انقر فوق تحليل ، ثم معايرة. حدد التطوير التنظيمي غير المعاير في الواجهة المنبثقة.
تحقق من المعايرة العامة في الجزء السفلي الأيسر من الواجهة السفلية ، وانقر فوق موافق. انقر فوق تحليل ، واضبط المقياس ، ثم قم بإزالة المقياس. تحقق من العالمية أدناه ، وانقر فوق موافق.
انقر فوق تحليل ، ثم اضبط القياسات. حدد منطقة العنصر في الواجهة المنبثقة. تحقق من الحد الأدنى أدناه لقياس النطاق المحدد فقط ، وانقر فوق موافق.
انقر فوق الصورة ، واضبط ، ثم العتبة ، وحرك شريط التمرير في منتصف الواجهة المنبثقة. لتحديد العتبة المناسبة بحيث يتم تحديد جميع الأهداف المراد اختبارها في صورة واحدة. وانقر فوق تعيين.
انقر فوق تحليل ، ثم قم بالقياس ، واحفظ التواريخ. Alizarin Red Staining هي طريقة حساسة ومحددة لقياس التغيرات في تمعدن العظام في يرقات الزرد. في تسعة أيام بعد الإخصاب ، يتم تمعدن العديد من عظام الهيكل العظمي للرأس مثل parasphenoid و opercular و ceratobranchial و notochord وبالتالي ملطخة باللون الأحمر.
في المقابل ، تظهر الهياكل غير العظمية مثل otoliths باللون البني الأسود. أظهر التحليل الرقمي الذي تم إجراؤه لتحديد إجمالي المساحة الملطخة انخفاضا كبيرا في المنطقة الملطخة ل 10 و 20 ملليغرام لكل لتر من مجموعات معالجة أسيتات الرصاص. أظهرت التغييرات في تمعدن العظام الاعتماد على الجرعة.
للحصول على تأثير تلطيخ وملاحظة أفضل ، من المهم إزالة الصبغة الأصلية ليرقات الزرد ، وإزالة الفقاعات بعد التبييض.
اعرض النص الكامل واحصل على الوصول إلى آلاف الفيديوهات العلمية
نظرة عامة
تستخدم هذه الدراسة صبغ أحمر الأليزارين لإثبات أن التعرض لخلات الرصاص يؤدي إلى تغيرات في كتلة العظام في يرقات سمك الزيبرا. وتعد هذه الطريقة قابلة للتكيف لاستقصاء فقدان العظام الناتج عن مختلف المواد السامة الخطرة.
مكونات الدراسة الرئيسية
مجال العلم
- علم الأعصاب
- علم السموم
- علم الأحياء النمائي
خلفية علمية
- يُعد صبغ أحمر الأليزارين تقنية تُستخدم لتصور الهياكل العظمية.
- تعتبر أسماك الزيبرا كائناً نموذجياً لدراسة تطور العظام والسمية.
- يُعرف خلات الرصاص بأن لها تأثيرات سامة على الأنظمة البيولوجية.
- يتميز هشاشة العظام بانخفاض كتلة العظام، وهو ما يمكن نمذجته في أسماك الزيبرا.
الغرض من الدراسة
- لتقييم تأثير خلات الرصاص على كتلة العظام في يرقات zebrafish.
- لتأسيس طريقة للكشف عن سمية العظام الناتجة عن المواد الكيميائية.
- لتسهيل مقارنات التغيرات الهيكلية عبر العينات.
الطرق المستخدمة
- صباغة نسيج سمكة الزيبرا المثبت بصبغة أحمر الأليزارين.
- تثبيت يرقات سمكة الزيبرا في البارافورمالدهيد ومحلول PBS.
- غسل اليرقات باستخدام Tris HCL أو كلوريد المغنيسيوم.
- إجراءات إزالة الصبغة كما هو موضح في المخطوطة.
النتائج الرئيسية
- أدى التعرض لخلات الرصاص إلى تغيرات ملحوظة في كتلة العظام.
- وفرت طريقة الصبغ سجلاً دائماً للتغيرات الهيكلية.
- تدعم النتائج استخدام zebrafish كنموذج لدراسة هشاشة العظام.
- تسمح المنهجية بالبحث في مواد سامة خطرة أخرى.
الاستنتاجات
- يعد صبغ أحمر أليزارين فعالاً لتقييم سمية العظام في أسماك الزيبرفيش.
- تسلط الدراسة الضوء على إمكانات أسماك الزيبرفيش في أبحاث السموم.
- يمكن للأبحاث المستقبلية التوسع في دراسة تأثيرات المواد السامة المختلفة على صحة العظام.
الأسئلة الشائعة
الأهمية التنفيذية في الصناعة
تتيح هذه الطريقة الكشف المبكر عن فقدان العظام المستحث كيميائياً في يرقات zebrafish، مما يدعم تقليل المخاطر الآلية في علم السموم والتحقق من الأهداف للمسارات المتعلقة بصحة الهيكل العظمي. ومن خلال قياس التغيرات في الأنسجة المتمعدنة عبر صبغ alizarin red، توفر هذه الطريقة قراءة قابلة للتكرار ومعتمدة على الجرعة لتقييم تأثيرات المركبات على تمعدن العظام. ويدعم هذا النهج الثقة التنبؤية في تحسين المركبات الرائدة وفحوص السلامة قبل السريرية للمركبات النشطة عظمياً.
التطبيقات الاستراتيجية في البحث والتطوير في مجال الأدوية الحيوية
الاكتشاف المبكر والتحقق من الهدف
- القيمة العلمية: تتيح استقصاء الفرضيات العلاجية المتعلقة بتمعدن العظام وسلامة الهيكل العظمي.
- القيمة التشغيلية: تدعم الحد من المخاطر البيولوجية من خلال توفير سجل دائم وقابل للقياس للتغيرات الهيكلية عبر العينات.
- القيمة التنبؤية: تسهل عملية فرز المحافظ الدوائية عن طريق تحديد المركبات ذات التأثيرات المعتمدة على الجرعة على كتلة العظام في مراحل مبكرة من مرحلة الاكتشاف.
الفحص وتطوير المقايسة
- القيمة العلمية: توفر قياسات كمية قائمة على عتبة محددة للمساحة المصبوغة لإجراء مقارنة موضوعية بين مجموعات العلاج.
- القيمة التشغيلية: توحد بروتوكولات تحضير العينات والتصوير لضمان القابلية للتكرار والتوسع في التنسيقات متعددة الآبار.
- جاهزية المقايسة: تنتج مخرجات رقمية متوافقة مع تحليل ImageJ، مما يتيح الفحص عالي المحتوى لأنماط سمية العظام الظاهرية.
الأبحاث الانتقالية وما قبل السريرية
- القيمة العلمية: ينمذج الاستجابات الهيكلية ذات الصلة بالبشر للمواد السامة، مما يدعم مواءمة المؤشرات الحيوية الانتقالية لفقدان العظام.
- القيمة التشغيلية: يربط بين سير عمل الاكتشاف والعمليات قبل السريرية من خلال توفير مقايسة محفوظة قائمة على الفقاريات لتمعدن العظام.
- تخفيف المخاطر: يوجه قرارات التقدم المعدلة حسب المخاطر من خلال اكتشاف إشارات فقدان العظام قبل الدراسات التي تجرى على الثدييات.
تكامل مسارات العمل والتدفقات الإجرائية
تندرج هذه الطريقة ضمن تسلسل عملية الاكتشاف، بدءاً من التحقق من الهدف، مروراً بتحديد المركبات الرائدة، وصولاً إلى تقييم السلامة قبل السريرية، لا سيما بالنسبة للمركبات ذات التأثيرات المحتملة خارج الهدف على الأنظمة الهيكلية.
- بيولوجيا الاكتشاف: تدعم اختبار الفرضيات المتعلقة بالتأثيرات الكيميائية على مسارات نمو العظام وتمعدنها في نموذج فقاري.
- الفحص: تتيح توحيد المقاييس والقراءات الكمية للكشف عن التغيرات المعتمدة على الجرعة في المنطقة المصبوغة.
- التحليلات: توفر قياسات للمساحة قائمة على عتبات معايرة، مما يسمح بالمقارنة الإحصائية لتمعدن العظام عبر الظروف المختلفة.
- الأبحاث الانتقالية: تربط بالاستمرارية قبل السريرية من خلال نمذجة الاستجابات الهيكلية المحفوظة للمواد السامة في يرقات zebrafish.
- إعادة الاستخدام المؤسسي: تؤسس منصة قابلة لإعادة الاستخدام لفحص مكتبات كيميائية متنوعة للكشف عن احتمالية سمية العظام.
التأثير التشغيلي والمؤسسي
- القيمة العلمية: تزيد من الثقة التنبؤية في التحقق من الأهداف من خلال تقليل الغموض الميكانيكي في المسارات المرتبطة بالعظام.
- القيمة التشغيلية: تعزز إمكانية التكرار والقابلية للتوسع من خلال خطوات التثبيت، والتلوين، والتقدير الكمي الرقمي الموحدة.
- القيمة الاستراتيجية: تحسن قرارات المضي قدماً أو التوقف من خلال تقديم إشارات كمية مبكرة حول احتمالية فقدان العظام.
- التأثير على مجموعة المشاريع: تدعم تحديد الأولويات المعدلة حسب المخاطر من خلال تحديد مخاطر السمية الهيكلية قبل الاستثمار الكبير.
اعتبارات التنفيذ
- يتطلب خبرة في التعامل مع سمك الزيبرا (zebrafish)، وعلم الأنسجة، والتصوير الفلوري/اللونيمتري.
- يعتمد على المجهر الستيري وبرامج تحليل الصور (مثل ImageJ) لإجراء قياسات كمية موحدة.
- يستلزم توحيد بروتوكولات الصبغ وإعدادات عتبة التحليل بين الفرق لضمان الحصول على نتائج قابلة للتكرار.
- يتضمن اعتبارات التكييف عند التوسع في أنظمة نماذج أخرى أو فئات كيميائية تتجاوز خلات الرصاص.
- يقتصر بسبب الحاجة إلى خطوات إزالة الصبغات وتصفية الخلفية لضمان الكشف الدقيق عن الإشارة.
