التقييم الوظيفي ل Kinesin-7 CENP-E في الخلايا المنوية باستخدام تثبيط الجسم الحي والتألق المناعي وقياس التدفق الخلوي

الانقسام الميوزي حدث تطوري محفوظ في حقيقيات النوى، وهو ضروري لتكوين الأمشاج والتكاثر الجنسي. يوفر بروتوكولنا طريقة فعالة لدراسات الانقسام الاختزالي وتكوين الحيوانات المنوية. لقد وصفنا سلسلة من البروتوكولات لتحليل الخلايا المنوية.

يمكن تطبيق هذه التقنية لمراقبة المغزل الميوتي، والكروموسومات المتماثلة، والعضيات تحت الخلوية في الخلايا المنوية. يمكن استخدام هذه الطريقة لتحليل الانقسام الاختزالي ، وتوليد نماذج حيوانية لتحرير الجينات ونقل الجينات في الأنسجة أو الأعضاء. يجب على المجربين الحفاظ على بيئة معقمة أثناء جراحة البطن ، والانتباه إلى درجة الحرارة والوقت والظروف التجريبية الرئيسية لهذا البروتوكول.

سيكون إثبات الإجراء هو الآنسة Meng-Fei Xu ، وهي خريجة دراسات عليا من مختبري. ابدأ في بناء نموذج ماوس تثبيط بروتين السنترومير E أو CENP-E بوساطة GSK923295 عن طريق ربط أطراف الماوس المخدرة وتثبيتها على صينية الشمع. بعد تطهير المنطقة الجراحية ، استخدم مشرطا معقما لعمل فتحة من خمسة ملليمترات في تجويف البطن للفأر متبوعا بوضع مشابك جراحية معقمة على الجلد.

ثم اسحب وسادة الدهون البربخية مع ملقط تشريح معقم لتحديد موقع الخصيتين بمساعدة ملاقط معقمة. بعد تثبيت الخصيتين بالملقط المعقم تحت مجسمة ، قم ببطء بحقن 10 ميكرولتر من GSK923295 في الأنابيب المنوية بتركيز نهائي قدره 10 ميكرومولار باستخدام 10 ميكرولتر من اليود. عند الانتهاء ، ادفع الخصيتين مرة أخرى إلى تجويف البطن وخيط موقع الجراحة كما هو موضح في المخطوطة النصية.

من أجل الجفاف المتدرج لخصيتي الفأر التي تم جمعها ، قم باحتضان العينة بالتتابع في وسائط مختلفة كما هو موضح في المخطوطة. بعد الحضانة التسلسلية ، ضع المنديل في أسفل صندوق التضمين وأضف البارافين المذاب في الصندوق. من أجل التصلب الكامل للبارافين ، قم بتبريد العينات عند أربع درجات مئوية لمدة ست ساعات.

في وقت لاحق ، ثبت العينة على حامل الميكروتوم الفائق مع الحفاظ على الزاوية بين العينة وسطح السكين عند 5 إلى 10 درجات. اضبط سمك الشريحة على خمسة ميكرومتر لتحضير المقاطع السميكة الخمسة ميكرومتر باستخدام ميكروتوم فائق. عند التحضير ، انشر شريحة العينة في حمام مائي عند 40 درجة مئوية قبل تجفيف الأقسام في مجفف الشرائح لمدة 12 ساعة عند 37 درجة مئوية.

بعد 12 ساعة ، قم بإجراء حضانة متسلسلة للشرائح كما هو موضح سابقا. بعد ذلك ، اشطف الشرائح بالماء المقطر لمدة خمس دقائق متبوعا بمحلول ماير الهيماتوكسيلين لمدة ست دقائق في درجة حرارة الغرفة. ثم شطف الشرائح الملطخة في الماء الجاري لمدة خمس دقائق واحتضانها بالماء المقطر لمدة دقيقتين.

احتضان الشرائح في 1٪ هيدروكلوريد الإيثانول لمدة ثلاث ثوان ثم شطف والمياه الجارية لمدة دقيقتين. قم بتلطيخ العينة بنسبة 1٪ من اليوزين لمدة 15 ثانية ، متبوعة بالحضانة التسلسلية. عند الانتهاء ، أغلق الشرائح باستخدام 15 ميكرولترا من العلكة المحايدة وغطاء 24 × 50 ملم.

للتألق المناعي ، ضع الشريحة في محلول استرجاع المستضد ليغلي تحت ضغط عال في قدر الضغط لمدة أربع دقائق لاسترجاع المستضد. ثم قم بتبريد الشريحة بشكل طبيعي إلى درجة حرارة الغرفة قبل شطفها مرتين بالماء المقطر لمدة خمس دقائق ومع برنامج تلفزيوني لمدة خمس دقائق. لتخلل الخلايا ، احتضان الشريحة في 500 ميكرولتر من 0.25٪ Triton X-100 في PBS لمدة 10 دقائق ثم شطف الشرائح مع PBS لمدة خمس دقائق ثلاث مرات.

لحجب المستضد ، احتضان العينة ب 300 ميكرولتر من 3٪ ألبومين مصل البقر أو BSA لمدة ساعة واحدة ومع الأجسام المضادة الأولية في 3٪ BSA في PBST لمدة 16 ساعة عند أربع درجات مئوية. بعد الحضانة ، ضع الشريحة في صندوق مرطب لمنع جفاف الأنسجة. أعد تسخين الشرائح بشكل طبيعي إلى درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة.

تخلص من الجسم المضاد الأساسي ، متبوعا بشطف الشريحة في PBST لمدة خمس دقائق ثلاث مرات. تمييع الأجسام المضادة الثانوية مع 3٪ BSA و PBST. ثم احتضان العينة بأجسام مضادة ثانوية مخففة لمدة ساعة إلى ساعتين عند 37 درجة مئوية.

بعد شطف العينة في PBST لمدة خمس دقائق خمس مرات ، قم بتلطيخ النوى ب 50 ميكرولتر DAPI لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة. قم بتركيب الغطاء القابل للانزلاق باستخدام وسيط التثبيت المضاد للتلاشي وأغلق غطاء الغطاء بطلاء الأظافر. لقياس التدفق الخلوي ، اجمع خصيتي الفئران في أطباق بتري ستة سنتيمترات وقطع الخصيتين إلى قطع ملليمتر مكعب واحد باستخدام مقص جراحي.

ثم هضم الخصيتين في ملليلتر واحد من 1 ٪ كولاجيناز في أنبوب طرد مركزي 1.5 ملليلتر لمدة 10 دقائق عند 37 درجة مئوية. لترسيب الخلايا المنوية ، قم بالطرد المركزي للعينة عند 1،000 جم لمدة خمس دقائق وتخلص من المادة الطافية قبل إضافة ملليلتر واحد من محلول التربسين EDTA بنسبة 0.25٪ في العينة لمدة 20 دقيقة عند 37 درجة مئوية. في وقت لاحق ، أجهزة الطرد المركزي العينة في 1،000 غرام لمدة خمس دقائق.

تخلص من المادة الطافية لاحتضان الخلايا المترسبة بملليلتر واحد من الإيثانول البارد بنسبة 70٪ لأكثر من ثماني ساعات عند أربع درجات مئوية. بعد الطرد المركزي عند 1،000 جم لمدة خمس دقائق ، اجمع رواسب الخلايا وصبغ الخلايا المنوية ب 500 ميكرولتر من يوديد البروبيديوم أو محلول تلطيخ PI عند 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة. بعد الحضانة ، قم بتصفية العينة باستخدام شاشة شبكية 300 للتخلص من حطام الخلية وجمع الخلايا في أنبوب تدفق لتخزين الخلايا عند أربع درجات مئوية.

كشف إشارات التألق وتشتت الضوء عند الطول الموجي للإثارة عند 488 نانومتر باستخدام مقياس التدفق الخلوي. تحليل محتوى الحمض النووي في العينة وتشتت الضوء باستخدام برنامج ModFit MF LT 32. بعد حقن الخصية من GSK923295 ، تم تغيير الموجة المنوية في الأنابيب المنوية بسبب تثبيط CENP-E.

ومع ذلك ، كانت الموجة المنوية في الأنابيب المنوية منتظمة ومنظمة في المجموعة الضابطة. لوحظ أن العديد من الكروموسومات المتماثلة لم تكن محاذاة في الصفيحة الاستوائية بعد تثبيط CENP-E. علاوة على ذلك ، أدى تثبيط CENP-E إلى زيادة الخلايا المنوية في الطور الأول في الأنابيب المنوية.

أظهر تحليل التألق المناعي انخفاض عدد الخلايا الإيجابية للبروتين المركب المضاد للتشابك أو SYCP3 لكل نبيب منوي بعد تثبيط CENP-E. من ناحية أخرى ، لم تتأثر نقاط SYP3 لكل خلية طورية وامتدادات SYP3 لكل خلية في المجموعات GSK92395. زادت مسافات أقطاب المغزل في الخلايا المنوية في الطور الأول بسبب تثبيط CENP-E.

يوضح التحليل التمثيلي أن تثبيط CENP-E أدى إلى انخفاض الخلايا الأحادية الصيغة الصبغية في مجموعة 923295 GSK عند مقارنتها بالسيطرة. لم تتأثر نسب الخلايا ثنائية الصيغة الصبغية والخلايا اختلال الصيغة الصبغية بشكل كبير بعد تثبيط CENP-E. على العكس من ذلك ، زادت نسب الخلايا رباعية الصيغة الصبغية في المجموعة GSK923295 من المجموعة الضابطة.

أظهر تحليل المجهر الإلكتروني النافذ للخلايا المنوية التنظيم المعطل للخلايا المنوية في المجموعة GSK923295. يجب على المجرب الانتباه إلى موضع الحقن وجرعة الدواء وطريقة الحقن وطريقة الخياطة أثناء جراحة البطن وحقن الخصية. تركز هذه التقنية جنبا إلى جنب مع التثقيب الكهربائي في الجسم الحي على البروتينات المستهدفة وأدوات تحرير الجينات في مجال الانقسام الانقسامي وتكوين الحيوانات المنوية.