طريقة كهربية فعالة وفعالة من حيث التكلفة لدراسة مسارات الإشارات الأولية المعتمدة على السيليوم في سلائف الخلايا الحبيبية
نوفمبر 30, 2021
هنا ، نقدم بروتوكولا كهربائيا قابلا للتكرار في المختبر للتلاعب الجيني بسلائف الخلايا الحبيبية المخيخية الأولية (GCPs) وهو فعال من حيث التكلفة وفعال وقابل للحياة. علاوة على ذلك ، يوضح هذا البروتوكول أيضا طريقة مباشرة للدراسة الجزيئية لمسارات إشارات القنفذ الأولية المعتمدة على السيليوم في خلايا GCP الأولية.
يوضح هذا البروتوكول طريقة تعديل وراثي مباشرة في المختبر للدراسة الجزيئية لمسار الإشارات الأولي المعتمد على السيليوم في مزارع سلائف الخلايا الحبيبية الأولية. نظرا للتكلفة ، وانخفاض الجدوى ، وضعف كفاءة طريقة النقل الحالية ، فإننا نقدم تقنية كهربائية بسيطة وفعالة من حيث التكلفة وفعالة للتحقيق في مسار الإشارات المعتمد على السيليوم في مزارع GCP الأولية. للبدء ، أضف 0.5 ملليلتر من وسط الاستزراع إلى كل بئر من لوحة الاستزراع المكونة من 24 بئرا والتي تحتوي على زلات غطاء مغلفة ، واجعلها دافئة عند 37 درجة مئوية في حاضنة ثاني أكسيد الكربون.
ماصة العدد المطلوب من الخلايا في أنبوب طرد مركزي دقيق معقم 1.5 ملليلتر وتدور عند 200x G لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة. تخلص من المادة الفائقة وأعد تعليق حبيبات الخلايا في 200 ميكرولتر من Opti-MEM. كرر هذا الإجراء مرتين لضمان عدم وجود وسيط استزراع متبقي في الأنبوب.
تعيين معلمات electroporation كما هو مدرج. ماصة تفاعل الكهربية بلطف لخلطها جيدا ، واستخدم طرف ماصة P200 طويل لنقل حجم دقيق يبلغ 100 ميكرولتر من الخليط إلى كوفيت الفجوة مليمترين. بمجرد أن يكون الكوفيت داخل غرفة الكوفيت ، اضغط على زر أوميغا الخاص بالمصدر الكهربائي ولاحظ قيمة المعاوقة من خلال الالتزام بحجم دقيق يبلغ 100 ميكرولتر.
يجب أن يكون نطاق قيمة المعاوقة حوالي 30 و 35. اضغط على زر البدء لبدء النبض. سجل القيم الحالية المقاسة بالجول الموضحة في إطار القراءة.
قم بإزالة الكوفيت من الغرفة. أضف على الفور 100 ميكرولتر من وسط الاستزراع المسخن مسبقا إلى الكوفيت وأعد تعليقه عن طريق السحب لأعلى ولأسفل مرتين إلى ثلاث مرات. انقل تعليق الخلية على الفور إلى اللوحة المكونة من 24 بئرا والتي تم إعدادها مسبقا.
احتضان الخلايا عند 37 درجة مئوية في حاضنة ثاني أكسيد الكربون. راقب الخلايا تحت المجهر الفلوري في اليوم التالي. في هذه الدراسة ، بدت كفاءة الكهربية للمجموعات المعالجة ب DMSO و SAG قابلة للمقارنة.
يوضح التلطيخ المناعي لعلامة السيليوم الأولية Arl13b أن معدل هداب GCP عند div-2 من الثقافة في كل من المركبة والمجموعات المعالجة ب SAG. يوضح معدل الهدب النسبة المئوية ل Pax6 التي تعبر عن GCPs التي تحمل سيليوم أولي على سطح الخلية عند div-2 بعد الكهربية. يوضح الشكل زيادة كبيرة في توطين EGFP السلس على محور السيليوم الأولي لخلايا GCP للتعبير عن Pax6 على مدار 24 ساعة بعد العلاج SAG ، مما يشير إلى تنشيط عميق لمسار إشارات القنفذ الأولي المعتمد على السيليوم.
من أجل تحقيق كفاءة أعلى في التفريغ الكهربائي ، يجب على المرء ضمان نقاء عال للبلازميد المستخدم ، ولا توجد وسائط ثقافة متبقية في خليط البلازميد الكهربائي. يجب أن يكون هذا البروتوكول قابلا للتطبيق بشكل مباشر ومفيدا لتجارب التعديل الجيني في المختبر على الثقافات الأولية وأنواع الخلايا التي يصعب نقلها ، بما في ذلك الخلايا العصبية والخلايا الجذعية متعددة القدرات التي يسببها الإنسان.
اعرض النص الكامل واحصل على الوصول إلى آلاف الفيديوهات العلمية
نظرة عامة
تقدم هذه الدراسة بروتوكولاً قابلاً للتكرار للتثقيب الكهربائي في المختبر (in vitro)، مصمماً للتعديل الجيني لأسلاف الخلايا الحبيبية المخيخية الأولية (GCPs). ويركز البروتوكول على طريقة فعالة ومنخفضة التكلفة لدراسة مسارات إشارات Hedgehog المعتمدة على الهدب الأولي.
مكونات الدراسة الرئيسية
مجال العلوم
- علوم الأعصاب
- التلاعب الجيني
- إشارات الخلايا
خلفية علمية
- تعد سلائف خلايا الحبيبات المخيخية الأولية (GCPs) بالغة الأهمية لدراسة التطور العصبي.
- غالبًا ما تكون طرق عفن الخلايا (transfection) الحالية غير فعالة ومكلفة.
- يعتبر الهدب الأولي حيويًا لمختلف مسارات الإشارات، بما في ذلك إشارات Hedgehog.
- يوفر التثقيب الكهربائي (Electroporation) حلًا محتملاً لهذه التحديات.
الغرض من الدراسة
- تقديم تقنية تثقيب كهربائي فعالة لزراعة خلايا GCP.
- تسهيل دراسة التأشير المعتمد على الهدب الأولي.
- تحسين نتائج التلاعب الجيني في أنواع الخلايا التي يصعب نقل الجينات إليها.
الطرق المستخدمة
- استخدمت التجربة مزارع مخبرية من الخلايا السليفة الحبيبية (GCPs) الأولية.
- تضمن بروتوكول التثقيب الكهربائي معايير محددة لضمان التعديل الجيني الفعال.
- لم يُذكر استخدام أي نهج من نهج الأوميكس المتعددة في هذه الدراسة.
- شملت الخطوات الحرجة إعادة تعليق الخلايا وتسلسل التثقيب الكهربائي.
- استُخدم التلوين المناعي لتقييم معدلات تكون الأهداب وتنشيط مسارات الإشارات.
النتائج الرئيسية
- أظهر البروتوكول زيادة ملحوظة في تنشيط مسار إشارات Hedgehog في الخلايا السلفية الحبيبية (GCPs) المعالجة.
- كشف التلوين المناعي عن زيادة ملحوظة في معدل تكوين الأهداب في الخلايا السلفية الحبيبية (GCPs) بعد عملية التثقيب الكهربائي.
- قدمت الدراسة رؤى حول كفاءة التثقيب الكهربائي مقارنة بالطرق التقليدية.
- خلصت الدراسة إلى أن النقاء العالي للبلازميد أمر بالغ الأهمية لنجاح عملية التثقيب الكهربائي.
الاستنتاجات
- تقدم هذه الدراسة بروتوكولاً قيماً للتعديل الجيني في الخلايا الحبيبية المخيخية (GCPs) الأولية.
- تعزز هذه النتائج فهم آليات التأشير المعتمدة على الهدب الأولي.
- قد تشمل التطبيقات المستقبلية أنواعاً مختلفة من الخلايا التي يصعب إجراء عملية عفن (transfection) لها.
الأسئلة الشائعة
الأهمية الصناعية التنفيذية
تعد المعالجة الجينية الفعالة لسلف الخلايا الحبيبية الأولية (GCPs) أمراً ضرورياً لتوضيح آليات الإشارات المعتمدة على الهدب والتي تدعم مسارات التطور العصبي والأمراض. يوفر بروتوكول التثقيب الكهربائي هذا كفاءة عالية في ترنسفكشن الخلايا مع الحفاظ على حيويتها، مما يتيح استقصاءً قوياً لديناميكيات مسار Hedgehog في الأنظمة ذات الصلة بالأمراض. وتدعم هذه الطريقة الثقة التنبؤية في الاكتشافات المبكرة والتحقق من الأهداف لمعدِّلات مسارات الإشارات.
التطبيقات الاستراتيجية في البحث والتطوير للمستحضرات الصيدلانية الحيوية
الاكتشاف المبكر والتحقق من الهدف
- يتيح الاستقصاء الجيني الوظيفي لإشارات Hedgehog المعتمدة على الهدب في الخلايا السليفة الحبيبية (GCPs) الأولية.
- يدعم الحد من المخاطر الميكانيكية من خلال السماح بالتصور المباشر لتمركز مكونات المسار.
- يسهل التحقق من صحة الهدف من خلال التلاعب القابل للتكرار في عقد الإشارات في الخلايا ذات الصلة بالمرض.
الفحص وتطوير المقايسة
- يجهز أنظمة خلايا أولية موثقة لعمليات الفحص اللاحقة لمعدلات المسارات.
- يوفر كفاءة ترنسفكشن عالية (~80-90%) وقابلية للتكرار لنتائج المقايسات الكمية.
- يتيح تطوير مقايسات قابلة للتطوير وفعالة من حيث التكلفة لنماذج عصبية يصعب إجراء عملية الترنسفكشن لها.
الأبحاث الانتقالية وما قبل السريرية
- يربط النتائج المختبرية (in vitro) بالأنماط الظاهرية الخلوية ذات الصلة بالمرض لضمان الاستمرارية الانتقالية.
- يدعم اكتشاف المؤشرات الحيوية من خلال تمكين التتبع الديناميكي لتمركز بروتينات الإشارة.
- يقلل من المخاطر البيولوجية في مرحلة التطوير ما قبل السريري من خلال توفير بيانات ميكانيكية قوية.
تكامل خطوط المعالجة وسير العمل
يدمج هذا البروتوكول بين المراحل المبكرة من الاكتشاف والتحقق من الهدف، مما يربط بين التلاعب الجيني والتحليل الكمي للمسارات في الأنظمة العصبية الأولية.
- بيولوجيا الاكتشاف: تسهل اختبار الفرضيات وتوضيح المسارات في خلايا GCPs الأولية.
- الفحص: توفر عملية ترانسفكشن عالية الكفاءة وقابلة للتكرار لضمان جاهزية المقايسات والقراءات الكمية.
- التحليلات: تتيح قياس معدلات التهديب وتنشيط المسارات عبر التلوين المناعي والمجهر الفلوري.
- الأبحاث الترجمية: تربط الرؤى الميكانيكية المختبرية بالسياقات الخلوية ذات الصلة بالأمراض.
- إعادة الاستخدام المؤسسي: توفر منصة قابلة للتطبيق على نطاق واسع للتعديل الجيني في أنواع الخلايا الأولية التي يصعب التعامل معها.
التأثير التشغيلي والمؤسسي
- القيمة العلمية: تزيد من الثقة التنبؤية وتقلل من الغموض الميكانيكي في دراسات المسارات.
- القيمة التشغيلية: توحد المعالجة الجينية مع قابلية عالية للتكرار والتوسع.
- القيمة الاستراتيجية: تحسن قرارات المضي قدماً أو التوقف وكفاءة رأس المال من خلال تمكين الحصول على بيانات قوية في المراحل المبكرة.
- تأثير المحفظة: تدعم تحديد الأولويات المعدلة حسب المخاطر لأهداف ومعدلات مسارات الإشارات.
اعتبارات التنفيذ
- يتطلب خبرة في تقنيات زراعة الخلايا العصبية الأولية والتثقيب الكهربائي.
- يتطلب الوصول إلى أجهزة التثقيب الكهربائي والمجهر الفلوري لإجراء التحليل.
- يستلزم توحيد المعايير بين الفرق فيما يخص نقاء البلازميد وبروتوكولات إزالة الوسط الزرعي.
- قابل للتطبيق على أنواع أخرى من الخلايا الأولية التي يصعب نقل الجينات إليها من خلال تحسين البروتوكول.
- تعتمد الكفاءة على التحكم الدقيق في معلمات التثقيب الكهربائي وتحضير العينة.
الأسئلة الشائعة حول الأدوية البيولوجية
Chapters in this video
0:05
Introduction
0:42
Day In Vitro (DIV) 0: Electroporation for Overexpression of Hedgehog Receptor: pEGFP-Smo
2:28
Results: Assessment of Overexpression Efficiency and the Effects of SAG Treatment on Primary Cilium-Dependent Hedgehog Signaling Pathway
3:23
Conclusion
