تصوير ثلاثي الأبعاد عالي الدقة للأوعية الدموية لوسادة القدم في نموذج غرغرينا Murine Hindlimb

يقدم هذا البروتوكول كيفية إنشاء نموذج غرغرينا وسادة قدم الفأر باستخدام إدارة مثبط الكتلة وتخثر الشريان الفخذي. ثم يسمح التروية DiI بتصور عالي الدقة للأوعية الدموية لوسادة القدم. هذا النموذج مناسب سريريا ويمكن استخدامه لاختبار الأدوية قبل السريرية ولدراسة نقص تروية الأطراف.

يوفر التصور عالي الدقة للأوعية الدموية وسيلة سهلة تقنيا لتقييم الأوعية الدموية الجديدة. يحتوي نموذج الغرغرينا وسادة القدم هذا على تطبيقات مهمة في الأبحاث قبل السريرية لأمراض الشرايين الطرفية ونقص تروية الأطراف الحرجة. DiI perfusion هي أداة مفيدة لدراسة الأوعية الدموية الجديدة في النماذج الحيوانية.

سيوضح الإجراء أنطوان ريبيراس ، من المقيم الجراحي ، ويوليكسي أورتيز ، وهو باحث مشارك من مختبري. أولا ، اجعل حل DiI يعمل عن طريق إضافة 200 ميكرولتر من محلول مخزون DiI إلى 10 ملليلتر من محلول مخفف يعمل مباشرة قبل الاستخدام. رجه باليد حتى يمتزج جيدا.

قم بتوصيل اثنين أو ثلاثة من أجهزة التوقف ثلاثية الاتجاهات وإبرة فراشة قياس 25 في سلسلة. تحضير محاقن 10 ملليلتر مع أربعة ملليلترات من PBS ، و 10 ملليلتر من محلول DiI ، و 10 ملليلتر من الفورمالين المخزن مؤقتا بنسبة 10٪. قم بتوصيل المحقنة بالفورمالين بمنفذ التدفق القريب وحقن المحلول لطرد الهواء من الخط.

ثم أدر مفتاح التوقف لإغلاق المنفذ. كرر نفس الإجراء ، وقم بتوصيل المحاقن ب DiI ثم PBS بمنافذ التدفق المتوسطة والبعيدة على التوالي. بعد القتل الرحيم ، ضع الحيوان في وضع ضعيف على وسادة ماصة وقم بتأمين الإبطين والأطراف السفلية بالإبر.

باستخدام المقص ، قم بعمل شق عرضي لفتح تجويف البطن ، ثم قم بكشف وتقسيم الحجاب الحاجز الأيسر والأيمن للوصول إلى التجويف الصدري. قطع جدار الصدر على جانبي القص من الأضلاع السفلية إلى الأضلاع الأولى أو الثانية. استخدم مرقئ للاستيلاء على الطرف السفلي من القص وعكسه نحو رأس الحيوان لفضح التجويف الصدري.

حدد البطين الأيسر، الذي يبدو أفتح لونا من الأيمن. أمسك القلب بلطف باستخدام ملقط حاد وأدخل إبرة الفراشة في البطين الأيسر. استخدم مقص أو إبرة قياس 18 لثقب الأذين الأيمن ، مما يسمح لمحاليل الدم والتروية بالعودة إلى القلب لتصريفها.

افتح منفذ المحقنة باستخدام PBS وحقن اثنين إلى أربعة ملليلتر يدويا بمعدل ملليلتر إلى ملليلتر في الدقيقة لمدة دقيقة إلى دقيقتين لطرد الدم من نظام الأوعية الدموية. ضمان التروية الناجحة من خلال مراقبة النزيف من الأذين الأيمن. بعد الحقن ، أغلق منفذ حقنة PBS.

افتح منفذ المحقنة باستخدام DiI وحقن خمسة إلى 10 ملليلتر بمعدل ملليلتر إلى ملليلتر في الدقيقة لمدة خمس دقائق. بعد الحقن ، أغلق منفذ حقنة DiI وانتظر لمدة دقيقتين للسماح بدمج الصبغة قبل حقن المثبت. افتح منفذ المحقنة بالفورمالين وحقن خمسة إلى 10 ملليلتر بمعدل ملليلتر إلى ملليلتر في الدقيقة لمدة خمس دقائق.

بعد الحقن ، قم بإزالة الإبرة من البطين الأيسر. باستخدام مقص ثقيل ، قم بخلع الساق عند الكاحل ، وفصل القدمين اليسرى واليمنى تماما عن أسفل الساقين. ضع القدمين المحصودين في طبق بئر 12 مع واحد إلى ملليلتر من محلول الفورمالين بنسبة 10٪.

لف الطبق بورق القصدير وخزنه عند أربع درجات مئوية طوال الليل. في اليوم التالي ، استبدل المحلول المثبت في صفيحة بئر 12 بملليلتر إلى ملليلتر من PBS لكل بئر. قم بعمل شق طولي باستخدام مشرط على الجزء الأخمصي والظهري من القدم.

ثم باستخدام ملقط مسنن ومرقئ صغير ، قم بإزالة جميع الجلد بعناية من القدم والأرقام ، دون إتلاف الأنسجة الرخوة الكامنة. لتركيب الأنسجة ، ضع القدمين بشكل فردي بين شريحتين مجهريتين زجاجيتين مع وسادة خزعة رغوية مطوية فوق نفسها في كل طرف. استخدم مشبكين صغيرين لضغط الشرائح الزجاجية معا في كل نهاية.

بدلا من ذلك ، أعد وسادة القدم إلى صفيحة بئر 12 مع واحد إلى ملليلتر من PBS. بعد تغطيته بورق القصدير ، قم بتخزينه عند أربع درجات مئوية للحفاظ على التألق لمدة تصل إلى شهر واحد. قم بتشغيل نظام التصوير وبدء تشغيل برنامج الاكتساب واستخدام هدف تكبير منخفض أو فتحة رقمية منخفضة لالتقاط الصور.

انقر فوق نعم إلى مربع حوار تنشيط المرحلة. قم بتنشيط ليزر 561 نانومتر في علامة تبويب التكوين. على الشاشة الرئيسية ، قم بتنشيط مسار شعاع مرئي بالنقر فوق الزر المرئي.

اضبط كاشفا على نطاق 570 إلى 600 نانومتر بالنقر فوق خانة الاختيار النشطة المقابلة. حدد أيقونة مسح البلاط ضوئيا في علامة تبويب الاكتساب وقم بتعيين الدقة المطلوبة. ضع عينة الأنسجة المثبتة الجافة المضغوطة بين الشرائح الزجاجية على مرحلة المجهر وجلب الأنسجة إلى التركيز.

انتقل إلى زاوية واحدة من العينة. ضمن قائمة مسح البلاط ، انقر فوق الزر وضع علامة. انتقل إلى الزاوية المقابلة وانقر على زر موضع العلامة مرة أخرى بتعيين حدود المسح.

لتعيين عمق مكدس Z ، انقر فوق الزر المباشر. انتقل إلى وسط العينة واستخدم مقبض المحور z للتمرير إلى أسفل العينة. في علامة التبويب الاستحواذ ضمن قائمة Z-stack ، انقر فوق الزر "ابدأ".

مرر إلى أعلى العينة وانقر على زر الإنهاء. انقر فوق حجم z-step واضبطه على القيمة المطلوبة. ثم انقر فوق ابدأ لبدء الحصول على الصور.

يوضح الشكل التباين في فقدان الأنسجة الذي يمكن توقعه من هذا النموذج بعد أسبوع واحد من الجراحة مع تسجيل درجات FABER في الزاوية اليمنى السفلى من كل صورة. تكشف صور الفحص المجهري لإعادة البناء عن تشريح الأوعية الدموية الطبيعي في وسادة القدم الضابطة غير المربوطة مقارنة بالتروية المتناقصة بشدة إلى وسادة القدم في الطرف الخلفي المربوط بعد خمسة أيام من الجراحة. بعد 20 يوما من الجراحة ، تحسنت التروية إلى وسادة القدم بشكل كبير ، وإن لم يكن إلى حد التحكم غير المربوط.

يوضح الفيديو أنه تم إنشاء عرض السطح بعد ذلك باستخدام وظيفة الرسوم المتحركة. اغسل جميع فقاعات الهواء من مجموعة التروية. إذا توسعت الرئتين وتحولت إلى اللون الوردي أثناء التروية ، فقد اخترقت الإبرة البطين الأيمن ويجب سحبها قليلا.

يمكن استخدام أنسجة الأطراف للتلطيخ المناعي لتقييم نخر العضلات ، وتجديد الأنسجة ، وكثافة الأوعية الدموية ، وتجنيد الخلايا السلفية ، وخلايا إصلاح الأنسجة الأخرى. تم استخدام تقنية التروية DiI في نموذج الغرغرينا الفئرانية هذا في دراسات العلاجات الجينية والخلوية. يهدف البحث إلى تحسين التروية في أطراف المرضى الذين يعانون من نقص تروية الأطراف الحرجة.