جيل من هوك الإقفارية-Reperfusion نموذج باستخدام الجنين الفرخ النامية لمدة ثلاثة أيام

مرحبا، أنا الدكتور سيد شداب رضا، الباحث الرئيسي في مختبر الخلايا الجذعية والأعصاب التصالحية، الموجود في قسم التكنولوجيا الحيوية في حرم جامعة إيرا، لوكناو، الهند. في مختبري، نسعى جاهدين لفهم الآلية المرضية الفسيولوجية الكامنة وراء اضطرابات نقص التروية والتدخلات التي يمكن أن تعكس تلك العمليات. في هذا السياق، ونحن كثيرا ما تستخدم في المختبر ونموذج في الجسم الحي من السكتة الدماغية.

في الآونة الأخيرة ، أنشأنا نموذج إصابة نقص التروية في ثلاثة أيام تطوير جنين الفرخ. لذا الآن طلابي سيريك كيف تكرر إصابة نقص التروية في جنين فرخ يتطور لثلاثة أيام الآن سنريك كيف تصنعين الإقفارية في جنين الفرخ لثلاثة أيام

نموذجنا فعال من حيث التكلفة وفعال من حيث الوقت وقابل للاستنساخ للغاية. لذلك دعونا نبدأ. اليوم الأول

متطلبات اليوم الأول. إجراء. تنظيف البيض يوم الصفر مع 70٪ الإيثانول باستخدام مناديل ورق الأنسجة. بعد ذلك، اكتب اليوم الحالي، والتاريخ، على البيض مع علامة OHP ومن ثم وضع البيض في حاضنة البيض مع درجة حرارة 36 إلى 37 درجة مئوية والرطوبة 60 إلى 65٪.

احتضن البيض لمدة 24 ساعة القادمة. اليوم الثاني متطلبات لليوم الثاني. إجراء.

مسح مقص الجراحية مع 70٪ الإيثانول أو تليها الأوتوكلاف. بعد 24 ساعة من الحضانة، قم بإزالة البيضة من الحاضنة لطبقاتها. بعد ذلك ، قم بإرفاق قطعة صغيرة من Sellotape بطول وعرض بوصة واحدة تقريبا إلى حافة البيضة ثم قم بعمل ثقب صغير في حافة قشر البيض باستخدام مقص الحافة الحاد المدبب يليه إدخال حقنة خمسة مل بزاوية 75 درجة تقريبا.

بعد إدخال الإبرة في كيس صفار، سحب ببطء خمسة إلى ستة مل من الألبومين. بعد إزالة الألبومين، إعادة ختم الحفرة مع Sellotape ووضع البيض مرة أخرى في حاضنة البيض 37 درجة مئوية لمدة 48 ساعة القادمة. اليوم الرابع

متطلبات لليوم الرابع. إجراء. إعداد محلول Ringer، المالحة العادية 0.9٪، وحاجز الفوسفات X واحد المالحة وفقا للجداول الواردة في هذه المخطوطة. ثم الأوتوكلاف الحلول الثلاثة.

بعد الأوتوكلاف، يمكن وضع الحلول المعنية في درجة حرارة الغرفة. بعد ذلك، أخرج البيضة من حاضنة البيض ب درجة 37. الآن، قبل قطع القشرة، تغطية مساحة النوافذ مع Sellotape.

والآن جعل حفرة صغيرة على قشر البيض والبدء في قطع فتحة دائرية. تعرف هذه العملية باسم الإطارات. تأكد من أن القطع الدائري كبير بما يكفي بحيث يمكن الوصول إلى الجنين بسهولة من أي اتجاه ، حيث قد يتعين تعديل وضع البويضة وفقا لوضع الجنين.

الآن، وذلك باستخدام مجهر جراحي تكبير ستيريو، حدد موقع الشريان الحيوي الأيمن أو RVA. هنا، يشير السهم إلى مرحلة نمو الجنين التي تستمر ثلاثة أيام. مرة واحدة يقع RVA، مع استخدام إبرة 26 G جعل اثنين من ثقوب صغيرة على الجانبين الأيسر والأيمن من RVA.

بعد ذلك، قم بضبط مسبار تصوير تدفق الدم دوبلر على RVA. يجب وضع مسبار تصوير تدفق الدم دوبلر خمسة زائد ناقص ملليمتر واحد من موقع نقص التروية وثلثي الطرف البعيدة من RVA. خذ قراءة التدفق لمدة 30 ثانية إلى دقيقتين ، حسب الرغبة.

وهذا سيجعل من مرحلة القراءة normoxia. الآن يدويا العفن حافة الإبرة الشوكية لإعطاء حافة شكل هوك مع مساعدة من plier الأنف تليها ملقط الأسنان. الآن، باستخدام المتلاعب الدقيق، أدخل الإبرة الشوكية أسفل الشريان الحيوي الأيمن.

كنت على استعداد لرفع إبرة العمود الفقري. الآن بمساعدة المتلاعب الدقيق ، ارفع الشريان ببطء حتى يظهر تدفق الدم دوبلر انخفاضا لا يقل عن 80٪ في تدفق الشرايين. بمجرد أن يتم تحقيق انخفاض بنسبة 80٪ أو أكثر في تدفق دوبلر ، اترك الإبرة الشوكية مرفوعة إلى الأعلى ، وسحب الشريان لمدة خمس دقائق.

هذه ستكون فترة الإقفارية بعد هذا التوقيت الإقفاري لمدة خمس دقائق ، قم بتحرير الشريان ببطء بمساعدة المتلاعب الدقيق لاستعادة مستويات تدفق الدم الطبيعية. الآن يجب أن يظهر مقياس تدفق الدم دوبلر قراءات مماثلة لتلك التي لوحظت أثناء normoxia.

وستكون هذه هي فترة إعادة التروية في RVA. بعد عملية I / R ، ضع قطرتين أو ثلاث قطرات من 1X PBS على الجنين. وأخيرا، إعادة ختم النافذة مع Sellotape ومن ثم وضع البيض مرة أخرى في حاضنة البيض لمدة خمس ساعات و 55 دقيقة.

بعد خمس ساعات و55 دقيقة، أخرج البيضة من حاضنة البيض وضعها على صينية البيض وأعيد فتح النافذة. متطلبات العلاج. إجراء. لعلاج الشرايين بالأدوية أو المنشطات أو المثبطات ، يجب استئصال RVA بعد ساعة واحدة من عملية I / R.

إزالة الجنين من قذيفة عن طريق إخراجه من قذيفة على طبق بيتري 100 ملم معقمة. بمجرد إطلاق الجنين في طبق بيتري ، اقتطع RVA باستخدام القزحية العينية في توجيه المجهر الجراحي للتكبير ستيريو. يجب أن يصل بعد استئصال RVA إلى 15 زائد ناقص 1 ملليمتر من الجذع واثنين زائد ناقص ملليمتر واحد نحو الجذع.

بعد استئصال RVA، اغسله مع برنامج تلفزيوني 1X في طبق بيتري جديد معقم. للعلاجات المطلوبة، ضع الشريان في أنبوب طرد مركزي معقم 1.5 ملليلتر مملوء ب 500 ميكرولتر من محلول رينغر. وبعد وضع الشريان في أنبوب الطرد المركزي، وضعت في حاضنة مختبر 37 درجة مئوية لمدة خمس ساعات.

بعد خمس ساعات من الحضانة، أخرج RVA من حاضنة مختبر 37 درجة مئوية واذهب للعلاجات المطلوبة. والآن، لعرض النتائج. للتحقق من فائدة نموذجنا في أبحاث التروية في الشرايين الإقفارية ، نظرنا أولا إلى أنشطة البروتينات التنظيمية للأوكسجين 150 أو ORP150 ، وأول أكسيد السيتوبلازمي الفائق dismutase واحد أو SOD1 والكاتالاس.

وأظهرت RVAs I /R المعالجة زيادة نشاط ORP150, SOD1 السيتوبلازمية والكاتالاس بالمقارنة مع مجموعة التحكم, ومع ذلك, تكملة مع N-أسيتيل-L-السيستين, أو NAC, وQUEncher ROS, خفض الإجهاد التأكسدي في مجموعة I / R, كما يمكن أن يكون واضحا في الشكل الحالي. لإنشاء فائدة هذا النموذج للتحقيقات الالتهابية ، نظرنا في التعبير عن I / R - 1 بيتا و TNF - ألفا في RVAs I / R المعالجة مقابل RVAs السيطرة. ووجد أن كلا من interleukins أن يكون الإفراط في التعبير عنها في مجموعة هوك - I / R مقارنة مع مجموعة التحكم.

مكملات نارينغينين, دواء مضاد للالتهابات, خفضت بشكل كبير مستويات IL1 بيتا وكذلك TNF-ألفا. بعد ذلك ، درسنا التعبير عن NLRP3 و NF-kappa بيتا من خلال النشاف الغربي. اكتشف هذا التحليل أدلة على تفعيل التهاب NLRP3 ، وكذلك بيتا NF-kappa استجابة ل I / R المنتجة في RVA.

على غرار النتائج السابقة، خفضت نارينجين التعبير عن NLRP3 وNF-كابا بيتا. أظهرت هذه النتائج أنه يمكن استخدام نموذجنا للتحقيق في التعديلات الالتهابية. بعد ذلك ، درسنا تأثير I / R على موت الخلايا المبرمج ومسارات autophagy.

أولا، في الشكل A، وصلنا إلى التعبير عن كاسباس-3 المشقوق. لاحظنا تعبيرا معززا عن caspase-3 المشقوق في مجموعة I/R مقارنة بمجموعة التحكم ، في حين أظهرت مجموعة I / R التي تتلقى ZVADFMK انخفاضا في التعبير عن caspase-3. وبالمثل بالنسبة للأوتوفاجي، أظهرت مجموعة I/R مستويات عالية من البروتين من LC3، وعلامة autophagosome Beclin-1، وهي منظمة رئيسية للأوتوفاجي في خلايا الثدييات، و ATG-7، وهو بروتين مطلوب للأوتوفاجي القاعدي، من مجموعة التحكم، في حين أظهرت المجموعات التي تتلقى 3-ma، وهو مثبط autophagy، انخفاضا في التعبير عن البروتينات الذاتية الثلاثة المذكورة أعلاه، كما هو واضح من الأرقام B إلى D.The الرقم E يوضح تأثير هوك بوساطة I / R على ambra-1 و ATG-7 مستويات مرنا.

وكانت هذه النتائج تتماشى مع النتائج السابقة، أي لوحظ تعزيز التعبير مرنا ل ambra-1 و ATG-7 في RVAs I/R المعالجة بالمقارنة مع الضوابط الخاصة بهم. ومع ذلك، تم عكس النتائج عندما تمت إضافة 3-ma إلى مجموعة I/R. الرقم الحالي يمثل فعالية نموذجنا لدراسة التعديلات في الحمض النووي.

لاحظنا مسحة حمض نووي مكثفة في المجموعة المعالجة بال I/R مقارنة بمجموعة التحكم. ومع ذلك، عكست مكملات NAC إلى مجموعة I/R R RVA النتيجة. لدراسة مدى فعالية نموذجنا على النقيض من النماذج الأخرى ، قارنا البيانات التي تم إنشاؤها بواسطة نموذج Hook-I /R ونموذج MCAO في التجربة الحالية.

باختصار ، كان التعبير عن البروتين المبرمج ، والكاسباس المشقوق - 3 ، والبروتينات الأوتوفاجية ، و Beclin-1 و ATG-7 ، وinterleukins الالتهابي ، TNF و IFN ، أعلى في RVAs المعالجة بال I / R مما كان عليه في RVAs التحكم. ومن المثير للاهتمام أن نموذج Hook-I/R أعطى نتائج مشابهة جدا لتلك التي حصل عليها نموذج MCAO ، سواء كان ذلك التحليل للإجهاد الالتهابي أو مسارات الموت الخلوية. يمكن استخدام نموذجنا لإجراء تجارب روتينية للإنخفار، إما بمفرده أو بالتوازي مع النماذج الحالية.

ومع ذلك ، أثناء محاكاة نقص التروية - reperfusion ، ينبغي اتخاذ أعلى الاحتياطات أثناء صنع الثقوب ، الجانب الأيمن والأيساري من RVA ، وأيضا أثناء انسداد أو إطلاق RVA بحيث لا ينبغي أن يضر أي شرايين أو عروق. في البيولوجيا الجزيئية الروتينية مثل النشاف الغربي ، محلل QRT-PCR ، يمكن ارتجال الأحماض الكيميائية وتقنيات التصوير لربط الفيزيولوجيا المرضية المرتبطة بإعادة التروية في ثلاثة أيام من تطور جنين الفرخ. ويمكن استخدام هذا النموذج بكفاءة لدراسة الميكانيكا الجزيئية في الحمض النووي والحمض النووي الريبي ومستويات البروتين.

كما أظهرنا لك، والنمذجة I / R في ثلاثة أيام النامية جنين الفرخ، ونحن نعتقد أن نموذجنا سوف تفتح آفاقا جديدة في مجال البحوث I / R. مع هذا العمل، وأتمنى لكم كل التوفيق لتجاربك. شكرًا لك.