تحريض التهاب الأمعاء عن طريق النقل المتبني للخلايا التائية المعدلة وراثيا CBir1 TCR CD4 ⁺ إلى الفئران التي تعاني من نقص المناعة

يفرض مرض التهاب الأمعاء ، أو IBD ، عبئا صحيا وماليا كبيرا على الأفراد والمجتمع. نموذج التهاب القولون هذا مفيد لدراسة آليات IBD وتقييم علاجات IBD. يوفر نموذج التهاب القولون الانتقالي بالتبني الخاص ب Cbir Flagellin المناعي نظرة ثاقبة حول كيفية تحفيز مستضد بكتيريا الأمعاء لاستجابات الخلايا التائية للحث على التهاب القولون.

بعد القتل الرحيم للفأر ، قم بعمل شق في البطن الأيسر يبلغ طوله حوالي سنتيمتر واحد واسحب الجلد بعيدا عن الأنسجة العضلية في البطن. ثم ، قم بعمل شق يبلغ طوله حوالي ثلاثة سنتيمترات في الأنسجة العضلية البطنية. بعد ذلك ، قم بإزالة الطحال بمقص وملقط معقمين.

ضع الطحال في طبق مستنبت يحتوي على خمسة ملليلترات من مخزن الغسيل العازل المبرد مسبقا. طحن الطحال مع السطح الخشن لاثنين من الشرائح الزجاجية المعقمة. انقل تعليق الخلية إلى أنبوب طرد مركزي سعة 50 ملليلتر عن طريق تمريره عبر مصفاة خلية سعة 100 ميكرومتر.

اشطف الشرائح الزجاجية وطبق الثقافة بخمسة ملليلترات من مخزن الغسيل العازل المبرد مسبقا ، وانقل مخزن الغسيل العازل إلى الأنبوب. قم بالطرد المركزي لتعليق الخلية ، وتخلص من السوبرناتانت ، وأعد تعليق الخلايا بخمسة ملليلترات من المخزن المؤقت لتحلل كلوريد الأمونيوم Tris المسخن مسبقا لكل طحال. احتضان لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة.

أضف 10 ملليلتر من مخزن الغسيل العازل المبرد مسبقا إلى الأنبوب. بعد ذلك ، قم بالطرد المركزي لتعليق الخلية ، وتخلص من السوبرنات ، وأعد تعليق الخلايا باستخدام 10 ملليلتر من المخزن المؤقت للعزل المبرد مسبقا. لحساب الخلايا ، امزج 10 ميكرولترات لكل من تعليق الخلية و Trypan Blue جيدا ، وقم بتحميل 10 ميكرولترات على شريحة.

ثم أدخل الشريحة في عداد الخلايا التلقائي للحصول على رقم الخلية القابل للحياة. الطرد المركزي تعليق الخلية المتبقية والتخلص من جميع supernatant. دوامة الجسيمات المغناطيسية CD4 المضادة للفأر ، وإضافة مباشرة 50 ميكرولتر من الجسيمات لكل 10 ملايين خلية ، وتخلط مع كريات الخلايا جيدا.

احتضني الخليط لمدة 30 دقيقة عند أربع درجات مئوية. انقل تعليق جسيمات الخلية إلى أنبوب تجميع معقم. أضف 3.5 ملليلتر من عازل العزل المبرد مسبقا إلى الأنبوب.

ضع الأنبوب على مغناطيس فصل الخلايا لمدة ثماني دقائق في درجة حرارة الغرفة. ثم ، استنشق بعناية من supernatant مع ماصة نقل ثلاثة ملليلتر. قم بإزالة الأنبوب من مغناطيس فصل الخلايا.

ثم ، أعد تعليق الخلايا ب 3.5 ملليلتر من العازل العازل المبرد مسبقا ووضع الأنبوب على المغناطيس لمدة أربع دقائق في درجة حرارة الغرفة. استنشق بعناية supernatant مع ماصة ثلاثة ملليلتر. وأخيرا، أعد تعليق الخلايا في ملليلتر واحد من مخزن FACS المخزن المؤقت المبرد مسبقا.

لنقل الخلايا إلى الفئران المتلقية ، أعد تعليق الخلايا التائية المتحولة والتناسلية الساذجة CD4 إلى 5 ملايين خلية لكل ملليلتر في 1x PBS. قم بتسخين الفئران تحت مصباح حراري وكبح جماح الفئران باستخدام مانع الماوس. حقن 200 ميكرولتر من تعليق الخلية عن طريق الوريد في الوريد الذيل للفئران.

بعد القتل الرحيم للفأر ، قم بإجراء شق جلدي بطني بطول سنتيمتر واحد تقريبا. اسحب الجلد بعيدا عن الأنسجة العضلية البطنية. ثم ، قم بعمل شق طوله ثلاثة سنتيمترات في الأنسجة العضلية البطنية.

بعد ذلك ، حدد coecum وإزالة القولون بأكمله باستخدام مقص وملقط معقم. بلل القولون ب PBS المبرد مسبقا في طبق ثقافي. شق القولون بالطول ، وشطفه مع PBS المبردة مسبقا.

قطع 1/3 من القولون طوليا. ضع شريط القولون في منشفة ورقية مع توجيه الجانب اللومني لأعلى. أداء التدحرج السويسري باستخدام مسواك.

ضع القولون السويسري في كاسيت ، وضع الكاسيت في الفورمالين المخزن مؤقتا بنسبة 10٪ لمدة 24 ساعة. تجفيف وتضمين البارافين القولون مع معالج آلي. ثم ، قم بقطع أقسام الأنسجة التي يبلغ طولها خمسة ميكرومترات على ميكروتوم.

قم بتركيب الأنسجة على الشرائح وقم بإجراء تلطيخ الهيماتوكسيلين والإيوسين. بدأت الفئران القاضية Rag في فقدان الوزن بعد حوالي ثلاثة أسابيع من نقل الخلايا ، ووصل وزنها إلى حوالي 80 إلى 85٪ من وزنها الأصلي بعد ستة أسابيع من نقل الخلايا. أظهرت الفئران المتلقية طول القولون القصير بعد ستة أسابيع من نقل الخلايا.

أظهرت الفئران المتلقية المزيد من تسلل الخلايا في الصفيحة المعوية بروبريا بعد أربعة أسابيع من نقل الخلايا. وأظهرت فقدان الخلايا الكأسية وتضخم الخلايا الظهارية المعوية بعد خمسة أسابيع من نقل الخلية، فضلا عن تآكل الغشاء المخاطي وتسلل الخلايا الالتهابية في تحت المخاطية للقولون بعد ستة أسابيع من نقل الخلية. زادت الدرجات النسيجية المرضية بشكل كبير من أربعة إلى ستة أسابيع.

في الوقت نفسه ، لم يكن هناك التهاب في الفئران الضربة القاضية Rag تلقي PBS وحدها. باستخدام هذا الإجراء ، يمكن تحديد مستويات السيتوكين القولوني بواسطة ELISA و qPCR.