زراعة الخلايا الليمفاوية في محاكاة الجاذبية الصغرى باستخدام نظام زراعة الخلايا الدوارة

تسمح لنا هذه التقنية بدراسة آثار محاكاة الجاذبية الصغرى على الخلايا المناعية لمساعدتنا على فهم أفضل لكيفية تأثير جوانب البيئة الفضائية على فسيولوجيا الإنسان على المستوى الجزيئي. هذه التقنية مجدية اقتصاديا وسهلة الإعداد والصيانة نسبيا مقارنة بإرسال مزرعة الخلايا إلى الفضاء أو طرق أخرى لإخضاع زراعة الخلايا لمحاكاة الجاذبية الصغرى على الأرض. يوصى بالسير ببطء أثناء ملء الأوعية لتجنب الفائض والانسكاب.

بعد إزالة الفقاعة الأولية ، تأكد من امتلاء الأوعية تماما باستخدام المحاقن. هذا سوف يقلل من فرص تشكيل فقاعة كبيرة طوال فترة العلاج. ابدأ بإخراج أوعية الاستزراع من العبوة البلاستيكية.

قم بتسمية كل وعاء على الحافة وفقا لنوع الخلية أو الخط المستخدم سواء كان في التحكم أو العلاج وأي معلومات أخرى ذات صلة. قم بتثبيت الوعاء وافتح منفذ التعبئة بعناية دون لمس ربط غطاء منفذ التعبئة أو الحلقة O. ضع الغطاء على وسادة الإيثانول بحيث يكون الوتد أو الحلقة O متجهة لأعلى أثناء ملء الوعاء.

لا تقم بإزالة الأغطية من منافذ الحقن. قم بتحميل الوعاء ب 10 مل من الوسائط الكاملة المناسبة لثقافة الخلية باستخدام ماصة مصلية معقمة ، وضع الغطاء بعناية على منفذ التعبئة. تأكد من إغلاق أغطية منافذ الحقن ومنفذ التعبئة بإحكام.

بعد ذلك ، ضع الأوعية المملوءة في حاضنة أثناء تنفيذ الخطوات اللاحقة لتجهيز الأوعية لزراعة الخلايا. استرجاع الأوعية المعدة للوسائط من الحاضنة. للتحكم في القارورة ، قم بتحميل دورق ثقافة التعليق T25 ب 10 مل من زراعة الخلايا من المخزون المحضر أعلاه.

أضف 10 مل من زراعة خلايا المخزون إلى أنبوب مخروطي منفصل سعة 15 مل ، والذي سيتم استخدامه لتحميل المحاقن. قم بفك أغطية منفذ المحقنة لإزالتها من السفينة وتأكد من أن محبس المخزون في وضع الفتح. قم بتثبيت الوعاء وافتح منفذ التعبئة بعناية دون لمس ربط غطاء منفذ التعبئة أو الحلقة O.

ضع الغطاء على وسادة الإيثانول بحيث يكون الوتد أو الحلقة O متجهة لأعلى أثناء ملء الوعاء. تأكد من أن المحبس في وضع الفتح. يمكن تفريغ الوعاء عن طريق سكب الوسائط من الوعاء في حاوية نفايات باستخدام ماصة مصلية.

بدلا من ذلك ، قم بشفط الوسائط باستخدام زجاج معقم بعد الماصة المتصلة بنظام التفريغ. أثناء استخدام ماصة أو نظام التفريغ ، تأكد من عدم لمس غشاء الأوكسجين لأن ذلك قد يؤدي إلى إتلافه وجعل الوعاء غير قابل للاستخدام. أغلق بإحكام الأنبوب المخروطي سعة 50 مل الذي يحتوي على مزرعة خلايا المخزون المحضرة واقلبه برفق عدة مرات لخلط المحتويات جيدا.

ارسم 10 مل من مخزون زراعة الخلايا من أنبوب 50 مل باستخدام ماصة مصلية معقمة جديدة. التقط الوعاء وقم بإمالته ، بحيث يكون منفذ التعبئة باتجاه الأعلى. ثم قم بتوزيع مخزون زراعة الخلايا بعناية في الوعاء من خلال منفذ التعبئة.

املأ الوعاء مباشرة إلى طرف منفذ التعبئة ، مع إمالة الوعاء لأسفل لتجنب الانسكاب. احرص على عدم لمس غشاء الأوكسجين بالماصة لأنه هش للغاية. بمجرد تحميل السفينة ، ضع غطاء منفذ التعبئة بعناية مرة أخرى دون لمس الحلقة O.

قم بإزالة أول حقنة سعة 3 مل من عبوتها وضخها عدة مرات لفكها. ثم قم بتوصيل المحقنة بأحد منافذ الحقن ، مع التأكد من أن المحقنة مكتئبة تماما. أغلق بإحكام الأنبوب المخروطي سعة 15 مل الذي يحتوي على 10 مل من مزرعة خلايا القسمة ، واقلبه برفق عدة مرات لخلط المحتويات جيدا.

وبالمثل ، قم بإزالة المحقنة الثانية سعة 3 مل من عبوتها وضخها عدة مرات. ثم شبه مغمورة بعناية هذه الحقنة في ثقافة الخلية من أنبوب مخروطي 15 مل ورسم بعض الثقافة. قلل من فقاعات الهواء عن طريق توزيع المحقنة بالكامل في الأنبوب وسحب 3 مل من الثقافة.

قم بتوصيل المحقنة المملوءة بمنفذ الحقنة المتبقي ، وقم بتعقيم المحاقن بعناية وحول منفذ التعبئة باستخدام وسادة الإيثانول. لا تحصل على الإيثانول على غشاء الأكسجين. كرر العملية للأوعية المتبقية.

إذا لم يتبق سوى القليل من زراعة الخلايا في الأنبوب المخروطي سعة 50 مل للوعاء الأخير، فاسترجع الكمية المتبقية من الأنبوب المخروطي سعة 15 مل المستخدم لتحميل المحاقن. تأكد من إغلاق محبس منفذ المحاقن للحد من هجرة الخلايا والفقاعات من المحاقن إلى الأوعية. اقلب الوعاء رأسا على عقب واضربه جانبا عدة مرات لجمع الفقاعات الأولية.

اقلب الوعاء بسرعة للخلف ليواجه لأعلى ، ثم بزاوية طفيفة متجهة بعيدا ، بحيث تطفو جميع الفقاعات إلى الجانب العلوي من الوعاء. قم بمناورة الفقاعات الموجودة أسفل المنفذ باستخدام المحقنة الفارغة ، وشاهدها تبدأ في الدخول إلى المنفذ. افتح كلا من محبس منفذ الحقنة.

اضرب الوعاء برفق لتشجيع الفقاعات على الطفو في المحقنة الفارغة. تمتص ببطء الفقاعات الكبيرة باستخدام المحقنة الفارغة مع الضغط بعناية على المحقنة الكاملة للحفاظ على الضغط في الوعاء ، حتى لا ينفجر غشاء الأكسجين. كرر هذه العملية عدة مرات لضمان إزالة جميع الفقاعات.

عندما تتم إزالة الفقاعات بشكل فعال ، أغلق محبس منفذ المحقنة. حافظ على تشغيل المحاقن أثناء العلاج للسماح بإزالة الفقاعات اللاحقة ، مع التأكد من أن الحجم في كلتا الحقنتين متساو تقريبا. امسح بعناية سطح القاعدة الدوارة وكابل الشريط باستخدام 70٪ إيثانول.

تأكد من توصيل كبل الشريط بمصدر الطاقة. ضع القاعدة الدوارة في الحاضنة ، وقم بتوصيل كابل الشريط بالقاعدة. ضع مصدر الطاقة بالقرب من الحاضنة ، ولكن خارجها.

قم بتوصيل وعاء معالجة SMG عن طريق اصطفاف خيوط الوعاء بالوتد الدوار وتدوير الوتد الدوار برفق على القاعدة عكس اتجاه عقارب الساعة. تأكد من توصيل السفينة بإحكام. الحفاظ على الحاضنة في حوالي 100٪ الرطوبة عن طريق ملء صينية المياه مع الأوتوكلاف RO المياه.

اضبط سرعة دوران الحاضنة لتتناسب مع سرعة ترسيب الخلايا ، بحيث لا تسقط الخلايا عبر الوسائط. في اليوم الأول من إعداد العلاج ، تحقق من تكوين الفقاعات كل بضع ساعات كما هو موضح في المخطوطة النصية. قم بإزالة الفقاعات مرة واحدة على الأقل يوميا للمضي قدما حتى نهاية مدة العلاج المطلوبة.

بمجرد انقضاء طول العلاج المخطط ، أوقف الدوران وفك الجهاز. قم بإزالة وعاء المعالجة عن طريق تثبيت الوعاء برفق أثناء تدوير الوتد الدوار للجهاز في اتجاه عقارب الساعة. أحضر دورق التحكم والتحكم والوعاء المعالج إلى خزانة أمان بيولوجي معقمة.

خذ كل وعاء باستثناء قارورة التحكم واقلبه ، بحيث يواجه لأسفل. ثم اضربه برفق لتعليق جميع الخلايا. ثم أدر الوعاء على جانبه مع منفذ التعبئة نحو الأسفل ، واضربه مرة أخرى لتوجيه الخلايا نحو منفذ التعبئة من أجل الشفط الفعال.

تعامل مع كل سفينة على حدة. قم بفك المحاقن من المنفذين وتوزيعها في النفايات البيولوجية. افتح محبس على منافذ الحقن.

قم بإزالة غطاء منفذ التعبئة بعناية وارسم المحتويات باستخدام ماصة مصلية معقمة سعة 10 مل ، مع إمالة الوعاء أثناء إفراغه. قم بتوزيع محتويات جميع مجموعات التحكم والعلاج في أنابيب مخروطية سعة 15 مل تحمل علامات فردية. أغلق كل أنبوب واقلبه برفق عدة مرات للتأكد من خلطه بشكل صحيح.

استخدم الطريقة المفضلة لتحديد تركيز وصلاحية ثقافة الخلية الناتجة للتحضير للمقايسات التجريبية اللاحقة. تمت مقارنة صلاحية بدء خط الخلايا NK-92 وكثافات الجلوس بقابلية البقاء النهائية والتركيزات النهائية الناتجة. بعد علاج رشاش الرشاش لمدة 72 ساعة ، تمت مقارنة حالتين من النتائج السلبية والإيجابية.

وعلى سبيل المقارنة، كان نطاق التركيز الأمثل لخط خلايا NK-92 المستخدم يتراوح بين 0.3 إلى 1.2 مليون خلية لكل ملليلتر مع وقت مضاعفة يبلغ حوالي يومين إلى ثلاثة أيام. كان الانتشار في مجموعة علاج SMG متساويا تقريبا عبر مجموعات التحكم والعلاج. كانت هذه المعلمات ضرورية للنجاح التجريبي في المراحل النهائية والخلايا الناتجة من المجموعتين الضابطتين كان أداؤها مشابها في المقايسات التجريبية النهائية.

من الأهمية بمكان مراقبة وحساب تكوين الفقاعات طوال فترة العلاج ، خاصة في مزرعة الخلايا التي تتعرض لمحاكاة الجاذبية الصغرى. يمكن أن يتسبب تكوين الفقاعات الكبيرة في تعطيل ديناميكيات السوائل داخل الوعاء ، وهذا سينفي بشكل أساسي حالة الجاذبية الصغرى المحاكاة.