نظام فسيولوجي دقيق لدراسة تفاعل الخلايا البطانية الكروية البيض أثناء الالتهاب

في هذا البروتوكول ، يتم استخدام فحص الموائع الدقيقة المحاكاة الحيوية ، والتي يمكن أن تعيد إنتاج بيئة الأوعية الدموية الدقيقة ذات الصلة من الناحية الفسيولوجية وإعادة إنتاج سلسلة التصاق / هجرة الكريات البيض بأكملها ، لدراسة تفاعلات الخلايا البطانية الكروية البيض في الأمراض الالتهابية.

تلعب تفاعلات الخلايا البطانية الكروية البيض دورا مهما في الأمراض الالتهابية مثل الإنتان. غالبا ما يسبب خلل تنظيم الالتهاب تغييرا في وظيفة حاجز بطانة الأوعية الدموية والاتجار المفرط بالكريات البيض ، مما قد يؤدي إلى تلف الأعضاء. إن فحص الموائع الدقيقة المحاكاة الحيوية ، ما نسميه bMFA ، يعيد إنتاج التضاريس وظروف التدفق لشبكات الأوعية الدموية الدقيقة داخل الجسم الحي ويسمح بالتقييم في الوقت الفعلي للتدحرج ، والالتصاق الثابت ، والانتشار ، وهجرة العدلات إلى حجرة الأنسجة.

تتمثل إحدى نقاط قوة فحص الموائع الدقيقة المحاكاة الحيوية في القدرة على استخدام الخلايا البشرية الأولية وعينات المرضى ذات الصلة سريريا لزيادة الترجمة السريرية وفحص العلاجات المحتملة بسرعة. وسيقوم بعرض الإجراءات السيد تشينغليانغ يانغ، وهو مساعد باحث دراسات عليا من مختبري. ابدأ في إدخال الأنبوب الذي يبلغ طوله حوالي بوصة واحدة داخل المنافذ باستخدام ملقط ناعم ، باستثناء منفذ مدخل واحد.

باستخدام مشابك الفك ، قم بتثبيت منفذي المخرج وحجرة الأنسجة معا. تمييع محلول مخزون الفيبرونيكتين إلى 100 ميكروغرام لكل ملليلتر مع PBS. قم بتحميل حقنة سعة ملليلتر واحد متصلة بإبرة حادة قياس 24 بمحلول الفيبرونيكتين المخفف وقم بتوصيل المحقنة بأنبوب طوله أربع بوصات.

أدخل الأنبوب في منفذ المدخل المفتوح ، ثم ادفع المكبس حتى يتم تحرير الفيبرونيكتين البشري من منفذ مدخل آخر وتثبيته. كرر العملية للمنافذ المتبقية حتى تمتلئ جميع القنوات وحجرة الأنسجة والأنابيب بمحلول الفيبرونيكتين البشري. قم بإزالة الإبرة ولكن حافظ على إدخال الأنابيب التي يبلغ طولها أربع بوصات وفتحها.

لإجراء إزالة الغاز ، قم بتوصيل الأنابيب غير المثبتة بالتمهيدي الهوائي المتصل بخزان نيتروجين مضغوط بضغط قدره خمسة أرطال لكل بوصة مربعة لمدة 15 دقيقة. تحت المجهر ، تحقق من عدم وجود فقاعات هواء محاصرة داخل القناة أو حجرة الأنسجة وأعد توصيل الجهاز إذا كانت فقاعات الهواء موجودة. قم بإزالة الجهاز من التمهيدي الهوائي واحتضنه عند 37 درجة مئوية لمدة ساعة واحدة.

باستخدام وسائط زراعة الخلايا البطانية الدقيقة للرئة البشرية التي تم تسخينها مسبقا ، اغسل جميع القنوات وحجرة الأنسجة. بعد حصاد الخلايا البطانية كما هو موضح في مخطوطة النص ، قم بتكسير الخلايا عن طريق الطرد المركزي لمدة خمس دقائق في 150 مرة G.In مضخة المحاقن القابلة للبرمجة ، وقم بتركيب حقنة سعة ملليلتر واحد وقم بتوصيل الأنابيب بالإبرة الحادة. اسحب ما يقرب من 20 ميكرولتر من تعليق الخلية إلى الأنابيب دون السماح لها بالدخول إلى برميل المحقنة.

قم بإزالة المشبك من منفذ منفذ إخراج الجهاز. قم بتوصيل الأنبوب بمنفذ المدخل دون إدخال أي فقاعة هواء في القناة. أوقف المضخة بمعدل تدفق من أربعة إلى ثمانية ميكرولترات في الدقيقة وراقب تحت المجهر.

أوقف المضخة عندما تمتلئ القنوات بالخلايا. مشبك المخرج وقطع أنابيب المدخل. ضع الجهاز في الحاضنة لمدة أربع ساعات عند 5٪ من ثاني أكسيد الكربون و 37 درجة مئوية.

بعد أربع ساعات من الحضانة ، قم بإعداد حقنة أخرى وملئها بوسائط زراعة الخلايا الطازجة. قم بتركيب المحقنة في مضخة حقنة وقم بتوصيلها بمنفذ المدخل. قم بإزالة المشبك من منفذ الإخراج.

مرر الوسائط الجديدة عبر الجهاز لمدة خمس دقائق تقريبا بسرعة تتراوح بين أربعة وثمانية ميكرولترات في الدقيقة لإزالة الخلايا العائمة أو غير المتصلة. قم بإعداد حقنة عن طريق ملئها بوسائط زراعة الخلايا الطازجة. قم بتركيب المحقنة في مضخة حقنة وقم بتوصيلها بمنفذ مدخل واحد مع إبقاء منفذ المخرج مفتوحا.

ضع الجهاز في حاضنة عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون. قم ببرمجة مضخة المحقنة لزراعة الخلايا البطانية تحت التدفق كما هو موضح في مخطوطة النص. باستخدام المجهر ، تحقق من bMFA بعد 48 ساعة من الثقافة تحت التدفق.

أشار المجهر البؤري إلى أن جميع أسطح القنوات الوعائية كانت مغطاة بالخلايا البطانية ، مما شكل تجويفا كاملا 3D في bMFA. بعد تحضير ثلاثة أجهزة bMFA مختلفة ، قم بتحميل ثلاثة محاقن بملليلتر واحد مع وسائط زراعة الخلايا أو TNF-alpha أو TNF-alpha جنبا إلى جنب مع مثبط PKC delta على التوالي ، حيث يتم استخدام TNF-alpha والسيتوكين الالتهابي لتحفيز الخلايا البطانية والعدلات. مثبط دلتا PKC هو مثبط جديد مضاد للالتهابات.

قم بتوصيل المحاقن الثلاثة المحملة بثلاثة أجهزة bMFA. باستخدام TNF-alpha أو TNF-alpha العازل مع مثبط إضافي ، عالج الخلايا البطانية الوعائية الدقيقة للرئة البشرية لمدة أربع ساعات بمعدل 0.1 ميكرولتر في الدقيقة. بعد عزل العدلات البشرية كما هو موضح في مخطوطة النص ، أعد تعليق العدلات في 999 ميكرولتر من مخزن HEPES المؤقت وأضف ميكرولتر واحد من محلول مخزون صبغة CFDA SE 10 ملليمولار إلى التعليق ، مما أدى إلى حل عمل 10 ميكرومولار من CFDA SE واحتضانه لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة.

اغسل الخلايا مرتين باستخدام مخزن HEPES المؤقت عن طريق الطرد المركزي للمحلول لمدة خمس دقائق عند 315 مرة G.بعد حساب الخلايا ، أعد التعليق عند 2 مليون عدلة لكل ملليلتر في وسائط زراعة الخلايا أو TNF-alpha أو TNF-alpha المضافة مع مثبط PKC delta واحتضانها في درجة حرارة الغرفة لمدة 15 دقيقة. املأ المحقنة بميكرومولار واحد من جاذب كيميائي ، fMLP ، تم إعداده في وسائط زراعة الخلايا. افتح مدخلا واحدا ومنفذ منفذ واحد من bMFA.

قم بإزالة أنبوب المنفذ من حجرة الأنسجة وأدخل أنبوب fMLP. حقن ما يقرب من 20 ميكرولتر من fMLP في حجرة الأنسجة لجميع bMFA ، وترك واحد يعالج مع وسائط زراعة الخلايا. قطع الأنابيب والمشبك عليه.

قم بملء المحقنة بحوالي 200 ميكرولتر من تعليق العدلات وقم بتركيب المحقنة على مضخة المحقنة. بعد وضع الجهاز على مرحلة المجهر المقلوب ، اضبط معدل التدفق على ميكرولتر واحد في الدقيقة وابدأ تشغيل المضخة. انتظر حتى تخرج قطرة صغيرة من تعليق العدلات من الأنبوب وأدخل الأنبوب في منفذ المدخل.

تتدفق العدلات ذات العلامات الفلورية إلى القنوات الوعائية وتتفاعل مع الخلايا البطانية وظروف التدفق ذات الصلة من الناحية الفسيولوجية. بعد 10 دقائق من بدء التجربة ، افتح برنامج تحليل الصور ، وقم بتبديل العدسة الموضوعية إلى 10x ، واستخدم عصا التحكم في المرحلة لتوسيط الجهاز تحت المجهر. للحصول على خريطة الالتصاق، انتقل إلى اكتساب، وانقر فوق مسح صورة كبيرة ضوئيا.

نافذة جديدة تنبثق. اختر عدسة الهدف 10x واضبط خيار الحقل، على سبيل المثال، 5 × 3. انقر فوق مسح ضوئي، وانقر فوق ملف، واحفظ خريطة الالتصاق.

للحصول على خريطة الترحيل لتحليل الترحيل، قم بتوسيط الجهاز تحت المجهر باستخدام عصا التحكم في المرحلة. انقر فوق عرض، عناصر التحكم في الاستحواذ، اكتساب ND. نافذة جديدة تنبثق.

قم بتعيين المسار لحفظ الملف واكتب اسم الملف. تحقق من وظيفة الصورة الكبيرة، واضبط منطقة المسح الضوئي، على سبيل المثال، 5 × 3. تحقق من وظيفة الوقت، واضبط الفاصل الزمني على أنه خمس دقائق، والمدة على أنها 60 دقيقة.

التقط صورا بفاصل زمني لحجرة الأنسجة، مع التقاط صورة واحدة كل خمس دقائق خلال الساعة التالية. تظهر محاكاة CFD نمط التدفق الرقائقي في القنوات الوعائية ، باستثناء مناطق التشعب حيث يتم إزعاج نمط التدفق. بعد إجراء فحص الموائع الدقيقة المحاكاة الحيوية ، كشفت صور تباين الطور أن أسطح القنوات الوعائية كانت مغطاة بخلايا بطانية ، ومحاذاة في اتجاه تدفق القص بعد 48 ساعة من الزرع.

تم إجراء التصوير الفلوري باستخدام المجهر البؤري ، مما يشير إلى أن الخلايا البطانية تشكل تجويفا كاملا ثلاثي الأبعاد في bMFA تم الحصول على خريطة التصاق العدلات ، والتي كشفت عن وجود التصاق كبير للعدلات بالخلايا البطانية في bMFA. كشفت خريطة هجرة العدلات في bMFA أنه عند تنشيط TNF-alpha ، تحدث هجرة كبيرة للعدلات داخل حجرة الأنسجة ، في حين لم يلاحظ أي هجرة من هذا القبيل دون تنشيط TNF-alpha. أظهرت خريطة الالتصاق التي تربط التوزيع المكاني للعدلات بمعدل القص أن التصاق العدلات حدث بشكل تفضيلي في الأوعية ذات معدل القص المنخفض ومناطق التشعب القريبة.

علاوة على ذلك ، يزيد علاج TNF-alpha بشكل كبير من الالتصاق ، والذي تم تثبيطه باستخدام مثبط PKC delta. وأشار تحليل صور الفاصل الزمني إلى أن تنشيط TNF للخلايا البطانية يزيد من هجرة العدلات استجابة ل fMLP ، في حين أن العلاج باستخدام مثبط دلتا PKC يقلل من الهجرة مقارنة بالخلايا المعالجة TNF-alpha. وبالتالي ، يمكن استخدام bMFA لاختبار فعالية علاج جديد لعلاج الأمراض الالتهابية.

يمكن أيضا استخدام bMFA لدراسة سلامة البطانة عن طريق قياس المتغيرات مثل النفاذية والمقاومة الكهربائية عبر البطانية ، وما يسمى TEER ، وتعبير جزيء الالتصاق أثناء الالتهاب. يمكن لفحص الموائع الدقيقة المحاكاة الحيوية أن يحاكي البيئة الدقيقة للأعضاء المختلفة ولا يقتصر على أنواع أو أنواع الخلايا المفردة ، ويمكنه أيضا نمذجة اتصال الخلية / الخلية الحاسم لوظيفة العضو ونمذجة الأمراض المختلفة.