نظام فسيولوجي دقيق لدراسة تفاعل الخلايا البطانية الكروية البيض أثناء الالتهاب
ديسمبر 9, 2021
في هذا البروتوكول ، يتم استخدام فحص الموائع الدقيقة المحاكاة الحيوية ، والتي يمكن أن تعيد إنتاج بيئة الأوعية الدموية الدقيقة ذات الصلة من الناحية الفسيولوجية وإعادة إنتاج سلسلة التصاق / هجرة الكريات البيض بأكملها ، لدراسة تفاعلات الخلايا البطانية الكروية البيض في الأمراض الالتهابية.
تلعب تفاعلات الخلايا البطانية الكروية البيض دورا مهما في الأمراض الالتهابية مثل الإنتان. غالبا ما يسبب خلل تنظيم الالتهاب تغييرا في وظيفة حاجز بطانة الأوعية الدموية والاتجار المفرط بالكريات البيض ، مما قد يؤدي إلى تلف الأعضاء. إن فحص الموائع الدقيقة المحاكاة الحيوية ، ما نسميه bMFA ، يعيد إنتاج التضاريس وظروف التدفق لشبكات الأوعية الدموية الدقيقة داخل الجسم الحي ويسمح بالتقييم في الوقت الفعلي للتدحرج ، والالتصاق الثابت ، والانتشار ، وهجرة العدلات إلى حجرة الأنسجة.
تتمثل إحدى نقاط قوة فحص الموائع الدقيقة المحاكاة الحيوية في القدرة على استخدام الخلايا البشرية الأولية وعينات المرضى ذات الصلة سريريا لزيادة الترجمة السريرية وفحص العلاجات المحتملة بسرعة. وسيقوم بعرض الإجراءات السيد تشينغليانغ يانغ، وهو مساعد باحث دراسات عليا من مختبري. ابدأ في إدخال الأنبوب الذي يبلغ طوله حوالي بوصة واحدة داخل المنافذ باستخدام ملقط ناعم ، باستثناء منفذ مدخل واحد.
باستخدام مشابك الفك ، قم بتثبيت منفذي المخرج وحجرة الأنسجة معا. تمييع محلول مخزون الفيبرونيكتين إلى 100 ميكروغرام لكل ملليلتر مع PBS. قم بتحميل حقنة سعة ملليلتر واحد متصلة بإبرة حادة قياس 24 بمحلول الفيبرونيكتين المخفف وقم بتوصيل المحقنة بأنبوب طوله أربع بوصات.
أدخل الأنبوب في منفذ المدخل المفتوح ، ثم ادفع المكبس حتى يتم تحرير الفيبرونيكتين البشري من منفذ مدخل آخر وتثبيته. كرر العملية للمنافذ المتبقية حتى تمتلئ جميع القنوات وحجرة الأنسجة والأنابيب بمحلول الفيبرونيكتين البشري. قم بإزالة الإبرة ولكن حافظ على إدخال الأنابيب التي يبلغ طولها أربع بوصات وفتحها.
لإجراء إزالة الغاز ، قم بتوصيل الأنابيب غير المثبتة بالتمهيدي الهوائي المتصل بخزان نيتروجين مضغوط بضغط قدره خمسة أرطال لكل بوصة مربعة لمدة 15 دقيقة. تحت المجهر ، تحقق من عدم وجود فقاعات هواء محاصرة داخل القناة أو حجرة الأنسجة وأعد توصيل الجهاز إذا كانت فقاعات الهواء موجودة. قم بإزالة الجهاز من التمهيدي الهوائي واحتضنه عند 37 درجة مئوية لمدة ساعة واحدة.
باستخدام وسائط زراعة الخلايا البطانية الدقيقة للرئة البشرية التي تم تسخينها مسبقا ، اغسل جميع القنوات وحجرة الأنسجة. بعد حصاد الخلايا البطانية كما هو موضح في مخطوطة النص ، قم بتكسير الخلايا عن طريق الطرد المركزي لمدة خمس دقائق في 150 مرة G.In مضخة المحاقن القابلة للبرمجة ، وقم بتركيب حقنة سعة ملليلتر واحد وقم بتوصيل الأنابيب بالإبرة الحادة. اسحب ما يقرب من 20 ميكرولتر من تعليق الخلية إلى الأنابيب دون السماح لها بالدخول إلى برميل المحقنة.
قم بإزالة المشبك من منفذ منفذ إخراج الجهاز. قم بتوصيل الأنبوب بمنفذ المدخل دون إدخال أي فقاعة هواء في القناة. أوقف المضخة بمعدل تدفق من أربعة إلى ثمانية ميكرولترات في الدقيقة وراقب تحت المجهر.
أوقف المضخة عندما تمتلئ القنوات بالخلايا. مشبك المخرج وقطع أنابيب المدخل. ضع الجهاز في الحاضنة لمدة أربع ساعات عند 5٪ من ثاني أكسيد الكربون و 37 درجة مئوية.
بعد أربع ساعات من الحضانة ، قم بإعداد حقنة أخرى وملئها بوسائط زراعة الخلايا الطازجة. قم بتركيب المحقنة في مضخة حقنة وقم بتوصيلها بمنفذ المدخل. قم بإزالة المشبك من منفذ الإخراج.
مرر الوسائط الجديدة عبر الجهاز لمدة خمس دقائق تقريبا بسرعة تتراوح بين أربعة وثمانية ميكرولترات في الدقيقة لإزالة الخلايا العائمة أو غير المتصلة. قم بإعداد حقنة عن طريق ملئها بوسائط زراعة الخلايا الطازجة. قم بتركيب المحقنة في مضخة حقنة وقم بتوصيلها بمنفذ مدخل واحد مع إبقاء منفذ المخرج مفتوحا.
ضع الجهاز في حاضنة عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون. قم ببرمجة مضخة المحقنة لزراعة الخلايا البطانية تحت التدفق كما هو موضح في مخطوطة النص. باستخدام المجهر ، تحقق من bMFA بعد 48 ساعة من الثقافة تحت التدفق.
أشار المجهر البؤري إلى أن جميع أسطح القنوات الوعائية كانت مغطاة بالخلايا البطانية ، مما شكل تجويفا كاملا 3D في bMFA. بعد تحضير ثلاثة أجهزة bMFA مختلفة ، قم بتحميل ثلاثة محاقن بملليلتر واحد مع وسائط زراعة الخلايا أو TNF-alpha أو TNF-alpha جنبا إلى جنب مع مثبط PKC delta على التوالي ، حيث يتم استخدام TNF-alpha والسيتوكين الالتهابي لتحفيز الخلايا البطانية والعدلات. مثبط دلتا PKC هو مثبط جديد مضاد للالتهابات.
قم بتوصيل المحاقن الثلاثة المحملة بثلاثة أجهزة bMFA. باستخدام TNF-alpha أو TNF-alpha العازل مع مثبط إضافي ، عالج الخلايا البطانية الوعائية الدقيقة للرئة البشرية لمدة أربع ساعات بمعدل 0.1 ميكرولتر في الدقيقة. بعد عزل العدلات البشرية كما هو موضح في مخطوطة النص ، أعد تعليق العدلات في 999 ميكرولتر من مخزن HEPES المؤقت وأضف ميكرولتر واحد من محلول مخزون صبغة CFDA SE 10 ملليمولار إلى التعليق ، مما أدى إلى حل عمل 10 ميكرومولار من CFDA SE واحتضانه لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
اغسل الخلايا مرتين باستخدام مخزن HEPES المؤقت عن طريق الطرد المركزي للمحلول لمدة خمس دقائق عند 315 مرة G.بعد حساب الخلايا ، أعد التعليق عند 2 مليون عدلة لكل ملليلتر في وسائط زراعة الخلايا أو TNF-alpha أو TNF-alpha المضافة مع مثبط PKC delta واحتضانها في درجة حرارة الغرفة لمدة 15 دقيقة. املأ المحقنة بميكرومولار واحد من جاذب كيميائي ، fMLP ، تم إعداده في وسائط زراعة الخلايا. افتح مدخلا واحدا ومنفذ منفذ واحد من bMFA.
قم بإزالة أنبوب المنفذ من حجرة الأنسجة وأدخل أنبوب fMLP. حقن ما يقرب من 20 ميكرولتر من fMLP في حجرة الأنسجة لجميع bMFA ، وترك واحد يعالج مع وسائط زراعة الخلايا. قطع الأنابيب والمشبك عليه.
قم بملء المحقنة بحوالي 200 ميكرولتر من تعليق العدلات وقم بتركيب المحقنة على مضخة المحقنة. بعد وضع الجهاز على مرحلة المجهر المقلوب ، اضبط معدل التدفق على ميكرولتر واحد في الدقيقة وابدأ تشغيل المضخة. انتظر حتى تخرج قطرة صغيرة من تعليق العدلات من الأنبوب وأدخل الأنبوب في منفذ المدخل.
تتدفق العدلات ذات العلامات الفلورية إلى القنوات الوعائية وتتفاعل مع الخلايا البطانية وظروف التدفق ذات الصلة من الناحية الفسيولوجية. بعد 10 دقائق من بدء التجربة ، افتح برنامج تحليل الصور ، وقم بتبديل العدسة الموضوعية إلى 10x ، واستخدم عصا التحكم في المرحلة لتوسيط الجهاز تحت المجهر. للحصول على خريطة الالتصاق، انتقل إلى اكتساب، وانقر فوق مسح صورة كبيرة ضوئيا.
نافذة جديدة تنبثق. اختر عدسة الهدف 10x واضبط خيار الحقل، على سبيل المثال، 5 × 3. انقر فوق مسح ضوئي، وانقر فوق ملف، واحفظ خريطة الالتصاق.
للحصول على خريطة الترحيل لتحليل الترحيل، قم بتوسيط الجهاز تحت المجهر باستخدام عصا التحكم في المرحلة. انقر فوق عرض، عناصر التحكم في الاستحواذ، اكتساب ND. نافذة جديدة تنبثق.
قم بتعيين المسار لحفظ الملف واكتب اسم الملف. تحقق من وظيفة الصورة الكبيرة، واضبط منطقة المسح الضوئي، على سبيل المثال، 5 × 3. تحقق من وظيفة الوقت، واضبط الفاصل الزمني على أنه خمس دقائق، والمدة على أنها 60 دقيقة.
التقط صورا بفاصل زمني لحجرة الأنسجة، مع التقاط صورة واحدة كل خمس دقائق خلال الساعة التالية. تظهر محاكاة CFD نمط التدفق الرقائقي في القنوات الوعائية ، باستثناء مناطق التشعب حيث يتم إزعاج نمط التدفق. بعد إجراء فحص الموائع الدقيقة المحاكاة الحيوية ، كشفت صور تباين الطور أن أسطح القنوات الوعائية كانت مغطاة بخلايا بطانية ، ومحاذاة في اتجاه تدفق القص بعد 48 ساعة من الزرع.
تم إجراء التصوير الفلوري باستخدام المجهر البؤري ، مما يشير إلى أن الخلايا البطانية تشكل تجويفا كاملا ثلاثي الأبعاد في bMFA تم الحصول على خريطة التصاق العدلات ، والتي كشفت عن وجود التصاق كبير للعدلات بالخلايا البطانية في bMFA. كشفت خريطة هجرة العدلات في bMFA أنه عند تنشيط TNF-alpha ، تحدث هجرة كبيرة للعدلات داخل حجرة الأنسجة ، في حين لم يلاحظ أي هجرة من هذا القبيل دون تنشيط TNF-alpha. أظهرت خريطة الالتصاق التي تربط التوزيع المكاني للعدلات بمعدل القص أن التصاق العدلات حدث بشكل تفضيلي في الأوعية ذات معدل القص المنخفض ومناطق التشعب القريبة.
علاوة على ذلك ، يزيد علاج TNF-alpha بشكل كبير من الالتصاق ، والذي تم تثبيطه باستخدام مثبط PKC delta. وأشار تحليل صور الفاصل الزمني إلى أن تنشيط TNF للخلايا البطانية يزيد من هجرة العدلات استجابة ل fMLP ، في حين أن العلاج باستخدام مثبط دلتا PKC يقلل من الهجرة مقارنة بالخلايا المعالجة TNF-alpha. وبالتالي ، يمكن استخدام bMFA لاختبار فعالية علاج جديد لعلاج الأمراض الالتهابية.
يمكن أيضا استخدام bMFA لدراسة سلامة البطانة عن طريق قياس المتغيرات مثل النفاذية والمقاومة الكهربائية عبر البطانية ، وما يسمى TEER ، وتعبير جزيء الالتصاق أثناء الالتهاب. يمكن لفحص الموائع الدقيقة المحاكاة الحيوية أن يحاكي البيئة الدقيقة للأعضاء المختلفة ولا يقتصر على أنواع أو أنواع الخلايا المفردة ، ويمكنه أيضا نمذجة اتصال الخلية / الخلية الحاسم لوظيفة العضو ونمذجة الأمراض المختلفة.
اعرض النص الكامل واحصل على الوصول إلى آلاف الفيديوهات العلمية
نظرة عامة
يصف هذا البروتوكول فحصًا ميكروفلويديًا محاكيًا حيويًا (bMFA) مصممًا لتكرار بيئة حيوية دقيقة فسيولوجية. إنه يمكّن دراسة تفاعلات الخلية اللمفاوية البطانية، خاصة في سياق الأمراض الالتهابية.
مكونات الدراسة الرئيسية
مجال العلوم
- علم الأعصاب
- بيولوجيا الخلية
- بحوث الأمراض الالتهابية
الخلفية
- التفاعلات بين الخلايا اللمفاوية والبطانية حاسمة في الفسيولوجيا المرضية للأمراض الالتهابية.
- يمكن أن يؤدي خلل التنظيم في الالتهاب إلى تلف الأعضاء بسبب تغيير في وظيفة الحاجز البطاني.
- يقلّد bMFA الظروف في الجسم الحي، مما يسمح بمراقبة سلوك الخلايا اللمفاوية في الوقت الحقيقي.
- استخدام الخلايا البشرية الأولية يعزز الأهمية السريرية للنتائج.
غرض الدراسة
- للتحقيق في التصاق وهجرة الخلايا اللمفاوية في بيئة خاضعة للرقابة.
- لتوفير رؤى حول آليات الاستجابات الالتهابية.
- لتسهيلات فحص التدخلات العلاجية المحتملة.
الطرق المستخدمة
- تطوير فحص ميكروفلويدي محاكي حيويًا.
- تقييم في الوقت الحقيقي لسلوك العدلات.
- استخدام الخلايا البشرية الأولية وعينات المرضى.
- إدخال أنابيب في منافذ ميكروفلويدية لإعداد الفحص.
النتائج الرئيسية
- نجح bMFA في تكرار البيئة الميكروية الوعائية.
- يكشف الرصد في الوقت الحقيقي أنماط التصاق وهجرة الخلايا اللمفاوية التفصيلية.
- تدعم النتائج إمكانية الترجمة السريرية للفحص.
- الإجراءات الموضحة تعزز من تكرارية واعتمادية النتائج.
الاستنتاجات
- الفحص الميكروفلويدي المحاكي الحيوي هو أداة قيمة لدراسة العمليات الالتهابية.
- يسمح باستكشاف ديناميكيات الخلايا اللمفاوية في سياق فسيولوجي ذي صلة.
- قد يؤدي هذا النهج إلى استراتيجيات علاجية محسنة للأمراض الالتهابية.
الأسئلة المتداولة
Executive Industry Relevance
The biomimetic microfluidic assay (bMFA) enables physiologically relevant modeling of leukocyte-endothelial interactions under controlled shear stress and vascular topology, addressing a critical gap in inflammatory disease target validation. By recapitulating the leukocyte rolling/adhesion/migration cascade using human primary cells, the system enhances predictive confidence in preclinical screening of anti-inflammatory therapeutics. This supports early de-risking of therapeutic candidates by linking mechanistic insights to translatable organ-level pathophysiology.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by quantifying neutrophil adhesion and migration in response to inflammatory stimuli such as TNF-alpha.
- Scientific Value: Supports functional target validation through modulation of adhesion molecule expression and endothelial permeability under physiologically relevant flow conditions.
- Scientific Value: Facilitates pathway clarification by correlating spatial adhesion patterns with low shear rate regions and vascular bifurcations identified via CFD modeling.
Screening & Assay Development
- Operational Value: Provides a standardized, reproducible platform for real-time quantification of leukocyte rolling velocity, adhesion frequency, and migration into tissue compartments.
- Operational Value: Enables rapid screening of potential therapeutics using human lung microvascular endothelial cells and primary neutrophils, increasing clinical translatability.
- Operational Value: Supports assay scalability through microfluidic network design derived from in vivo rodent microvascular topology and PDMS microfabrication.
Translational & Preclinical Research
- Translational Value: Uses human-related samples to bridge discovery findings with clinical relevance in inflammatory diseases such as sepsis.
- Translational Value: Measures endothelial integrity via permeability and trans-endothelial electrical resistance (TEER), enabling assessment of barrier function during inflammation.
- Translational Value: Models cell/cell communication critical to organ function, supporting preclinical continuity from target engagement to tissue-level response.
Pipeline & Workflow Integration
The bMFA integrates into the discovery continuum by enabling hypothesis-driven interrogation of leukocyte-endothelial interactions, supporting assay readiness for compound screening, and generating quantitative, imaging-based outputs for data-driven decision-making in lead optimization.
- Discovery Biology: Supports mechanistic de-risking by visualizing spatiotemporal dynamics of neutrophil adhesion and migration under controlled inflammatory stimulation.
- Screening: Delivers quantitative, multiplexed readouts including adhesion maps, migration maps, and endothelial activation states for compound efficacy ranking.
- Analytics: Generates shear rate-correlated adhesion profiles and time-lapse migration data enabling statistical comparison across treatment conditions.
- Translational Research: Connects endothelial activation and neutrophil trafficking to organ-level pathophysiology through permeability and TEER measurements.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable microfluidic platform adaptable to multiple disease models and cell types beyond neutrophil-endothelial interactions.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Reduces mechanistic ambiguity in leukocyte trafficking by decoupling shear stress, vascular geometry, and biochemical stimulation in a controlled environment.
- Operational Value: Ensures reproducibility through standardized fabrication, cell seeding under flow, and defined stimulation protocols using TNF-alpha and fMLP.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by providing early efficacy signals for novel inhibitors such as PKC delta inhibitor in neutrophil migration assays.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of anti-inflammatory candidates based on quantitative inhibition of adhesion and migration in human-relevant systems.
Implementation Considerations
- Requires expertise in microfluidic device fabrication, primary cell culture, and confocal microscopy for image acquisition and analysis.
- Depends on access to syringe pumps, pneumatic priming systems, and CFD simulation tools for shear rate mapping.
- Necessitates standardization across teams for consistent channel coating, cell seeding density, and stimulation timing to ensure data comparability.
- Involves adaptation considerations when extending the model to other vascular beds or cell types due to organ-specific shear profiles and endothelial heterogeneity.
- Limited by the need for meticulous degassing and bubble-free fluid handling to maintain laminar flow and accurate shear stress delivery.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:04
Introduction
1:13
Priming and Coating the Device with Human Fibronectin
3:01
Seeding Biomimetic Microfluid Assay (bMFA) with HLMVEC
4:37
Cell Culture Under Flow for 48 Hours
5:26
Cytokine and/or Therapeutic Treatment
6:19
Neutrophil Adhesion and Migration Experiment with bMFA
8:33
Acquire Image
9:59
Results: Biomimetic Microfluid Assay to Study Leukocyte-Endothelial Cell Interactions
12:06
Conclusion
