المجهر الطولي داخل الحيوية باستخدام نافذة تصوير الثدييات مع غطاء قابل للاستبدال

الغدة الثديية ديناميكية للغاية وتخضع لجولات متعددة من إعادة التشكيل طوال الحياة. يسمح بروتوكولنا بالتقاط الديناميكيات الخلوية التي تقود إعادة ترتيب الأنسجة في الغدة الثديية الصحية والمريضة. تتيح نافذة التصوير الثديي المزودة بغطاء قابل للاستبدال إجراء تصوير طولي داخل الجسم للغدة الثديية على مدى فترات زمنية طويلة تصل إلى عدة أسابيع.

يضمن الغطاء القابل للاستبدال لنافذة التصوير الثديي ظروف تصوير مثالية في جميع الأوقات ويسمح بمعالجة الأنسجة أو إعطاء الدواء بين جلسات التصوير. لا توفر طريقتنا رؤى ثاقبة لبيولوجيا الغدة الثديية الصحية فحسب ، بل تسمح لنا أيضا بدراسة بدء الورم الثديي وتطوره على مستوى الخلية الواحدة. ابدأ بوضع غطاء نافذة التصوير الثديي على سطح معقم وتطبيق غراء لاصق سيانوكريليت حول محيط غطاء الحافة بأكمله.

ضع بعناية غطاء زجاجي دائري 10 ملم أعلى الغطاء. استخدم عصا خشبية معقمة لوضع انزلاق الغطاء الزجاجي وتطبيق بعض القوة لدفعه لأسفل لضمان وجود ختم محكم الإغلاق بين انزلاق الغطاء الزجاجي وإطار الغطاء. تأكد من أن الزجاج لا يغطي الثقوب الموجودة في ذراعي الغطاء.

قم بتطهير الأغطية ونافذة التصوير الثديي عن طريق غمرها في 80٪ من الإيثانول لمدة 30 دقيقة على الأقل في طبق بتري مغلق. استخدم طرف قطني منقوع في الأسيتون لإزالة الغراء اللاصق السيانو أكريليت الزائد على الغطاء الزجاجي. لإعداد الفأر للجراحة، احلق المنطقة المحيطة بالغدة الثديية الرابعة باستخدام شفرة حلاقة.

استخدمي الحلمة الرابعة كعلامة فارقة وأزيلي الشعر الفضفاض باستخدام شريط لاصق. قم بإجراء اختبار سحب مخلب للتحقق مما إذا كان الحيوان مخدرا بشكل كاف. ارفعي الجلد بلطف باستخدام ملقط Graefe الناعم واستخدمي مقص زنبركي صغير لعمل شق قطري من 10 إلى 15 ملم في الجلد أعلى وسادة الدهون الثديية الرابعة استخدمي الحلمة الرابعة كنقطة توجيه وتأكدي من عدم قطع أو تلف الصفاق أو الغدة الثديية.

افصل الجلد عن وسادة الدهون الثديية وطبقات الأنسجة الأساسية باستخدام تشريح حاد يصل إلى خمسة إلى ثمانية ملليمترات في جميع أنحاء خط الشق لإنشاء جيب يناسب إطار نافذة التصوير الثديي. تحديد المنطقة ذات الاهتمام ، أو عائد الاستثمار ، استنادا إلى السمات العيانية للأنسجة الثديية ، بما في ذلك موقع العقدة الليمفاوية أو آفة الورم. حاول الحفاظ على عائد الاستثمار مركزيا فيما يتعلق بالشق.

التقط نافذة التصوير الثديي باستخدام ملقط معقم واختبر ما إذا كان الشق كبيرا بما يكفي لإدخال النافذة. إذا لزم الأمر، قم بتكبير الشق قليلا حتى تتناسب نافذة التصوير الثديي. قم بإزالة النافذة واستخدم خياطة حريرية 5-0 لوضع خيط خيط محفظة على بعد ملليمتر إلى مليمترين من حافة الشق بدءا من النهاية الذيلية ومن الخارج إلى داخل الجلد.

تحرك حوالي خمسة ملليمترات لأعلى على طول الشق ومرر خيط الخياطة عبر الجلد من الداخل إلى الخارج. كرر هذا الإجراء على طول حافة الشق ، وبالتالي إنشاء خياطة دائرية تتكون من خمس إلى ست حلقات. يجب أن يكون المخرج النهائي لخيط الخياطة على بعد حوالي مليمترين إلى خمسة ملليمترات من المدخل الأول.

قم بتركيب نافذة التصوير الثديي داخل الشق واستخدم ملقط Graefe لوضع الجلد بعناية في أخدود النافذة. تأكد من ترك حلقات الخيط في الخارج. اسحب حلقات خيط المحفظة واسحب طرفي الخيط برفق لشده في أخدود نافذة التصوير الثديي.

ربط مع عقدة جراحية وقطع الخيط الزائد. استخدم عود أسنان لتطبيق الفازلين على الحافة الداخلية للنافذة ، وتجنب الأنسجة الكامنة. ادفع إطار النافذة برفق لأسفل باستخدام ملقط معقم وضع الغطاء في إطار النافذة.

سيؤدي ذلك إلى تجنب وجود حجم من الهواء بين أنسجة الغدة الثديية وغطاء نافذة التصوير الثديي. ضع أطراف الملقط الرقيق من خلال الثقوب الموجودة في ذراعي الغطاء وشد الغطاء عن طريق لفه في اتجاه عقارب الساعة. إذا بقي بعض الهواء بعد شد الغطاء ، فقم بإدخال إبرة أنسولين معقمة عبر الجلد إلى التجويف بين الأنسجة الثديية والغطاء واسحب المكبس ببطء ، مما يخلق فراغا بين أنسجة الغدة الثديية وغطاء نافذة التصوير الثديي.

الآن يمكن ملاحظة العقدة الليمفاوية بسهولة بعد هذا الإجراء. افحص حالة إطار نافذة التصوير الثديي والغطاء، بما في ذلك ثبات الغرز أو أي تلف محتمل للغطاء. ضع الماوس على الترصيع بطريقة تسقط نافذة التصوير الثديي في ثقب تطعيم صندوق التصوير.

ضع شريطا شبه شفاف وورقيا على الجزء الخلفي من الماوس لتحقيق الاستقرار في الماوس وتقليل حركة الأنسجة بسبب التنفس. بالنسبة لجلسات التصوير التي تزيد مدتها عن ثلاث ساعات ، ضع إبرة مرنة تحت الجلد في عنق الماوس وقم بتأمينها بشريط ورقي. قم بتوصيل حقنة 10 ملم مع مزيج من العناصر الغذائية بأنبوب سيليكون مرن وادفع مزيج المغذيات حتى يصل إلى نهاية الأنبوب.

قم بتوصيل أنبوب السيليكون بالإبرة المرنة وحقن 50 ميكرولتر من المحلول المغروس كل 30 دقيقة. ضع الغطاء فوق صندوق التصوير لإغلاقه. ثم قم بتأمين صندوق التصوير في مرحلة المجهر.

تحقق من أن الماوس مستقر داخل صندوق التصوير. تحديد منطقة الاهتمام باستخدام وضع التألق اللاإفلاري للمجهر وتطبيق إعدادات المجهر. استخدم الدالة Spiral في وضع مستكشف برنامج التصوير لإنشاء مسح تجانب نظرة عامة كبيرة وإنشاء خريطة مرجعية للأنسجة.

حدد منطقة المصالح ضمن النظرة العامة الحلزونية ثم حدد المستويين Z العلوي والسفلي لتحديد مكدس Z. اضغط على Start (ابدأ) للحصول على مكدسات Z ثلاثية الأبعاد أو رباعية الأبعاد التفصيلية للأنسجة. ضع أطراف الملقط الرقيق من خلال فتحات نافذة التصوير الثديي في ذراعي الغطاء وقم بفك الغطاء عن طريق الالتواء عكس اتجاه عقارب الساعة.

بدلا من ذلك ، يمكن معالجة الأنسجة أو إعادة وضعها باستخدام ملقط حاد معقم لتحسين ظروف التصوير لمنطقة الاهتمام المحددة. ضع الفازلين على الحافة الداخلية لنافذة التصوير الثديي ، وتجنب الأنسجة الكامنة. ادفع إطار النافذة برفق لأسفل باستخدام ملقط معقم وضع الغطاء في إطار النافذة.

أخيرا ، ضع أطراف الملقط الرقيق من خلال ثقوب ذراعي الغطاء وخفف الغطاء عن طريق لفه في اتجاه عقارب الساعة. تم حقن فئران البلوغ Rosa26 Cre / ERT2 Rosa26 غشاء الطماطم GFP بجرعة منخفضة من تاموكسيفين ، مما أدى إلى إعادة تركيب أليل GFP غشاء الطماطم Rosa26 بوساطة Cre. تم تصوير الفئران في الأيام الأول والثالث والخامس لمتابعة التغيرات الديناميكية في الغدة الثديية النامية.

تظهر الصور التمثيلية تقديم 3D لقناة ثديية ممدودة ومتفرعة على مدار عدة أيام يتم تصويرها من خلال نافذة تصوير الثدي. يتم عرض صور المستوى Z المفردة للطرف المتفرع والفرع الممدود هنا. يتم تمييز الخلايا المفردة في السدى بواسطة العلامات النجمية البيضاء.

تظهر الصور التمثيلية العقدة الليمفاوية الإربية للفأر التي تم تصويرها من خلال نافذة تصوير الثدي. يصور الجيل التوافقي الثاني باللون الأخضر. يتم عرض الصور المقدمة 3D لبنية القناة الثديية لأنثى بالغة من غشاء E-cadherin CFP الماوس على مدى عدة أيام متتالية هنا.

تم استخدام نمط الكولاجين I لتتبع نفس عائد الاستثمار وتم استخدام إشارة غشاء E-cadherin CFP لوضع علامة على الخلايا القنوية. تم تصوير فئران كيكوم الخضراء والحمراء في اليوم صفر قبل وبعد التعرض للضوء البنفسجي. تكررت جلسات التصوير في الأيام الثاني والسادس و10 بعد التحويل.

تم تصوير نفس المنطقة من الغدة الثديية من خلال نافذة تصوير الثديية لمدة 10 أيام. تم تحويل المناطق الأصغر حجما ضوئيا في اليوم صفر وأظهرت معدل تخفيف مماثل للإشارة الحمراء Kikume بمرور الوقت ، مما يشير إلى معدل دوران متساو في جميع أنحاء الظهارة. تظهر صور التكبير / التصغير للمناطق المشار إليها عدم تجانس تكاثري على المستوى الخلوي بعد ستة و 10 أيام من تحويل الصور.

كشف القياس الكمي للنسبة الحمراء إلى الخضراء للخلايا المختلفة بعد 10 أيام من التحويل الضوئي عن معدلات تخفيف متغيرة للغاية لبعض الخلايا داخل نفس البيئة الدقيقة القنوية. تتمثل إحدى الخطوات الحاسمة في هذا الإجراء في فتح الغطاء بين جلسات التصوير. تعمل هذه الميزة الفريدة للنافذة على تحسين ظروف التصوير وتسمح بالتصوير الطولي للأنسجة.

ستسهل نافذة التصوير الثديي ذات الغطاء القابل للاستبدال الأسئلة الجديدة المتعلقة باختبار الأدوية وفحصها في الجسم الحي وسريع المفعول في مجال بدء الورم وتقدمه في الغدة الثديية للفأر.