قياس خصائص الهيكل العظمي الدوري للغشاء للجزء الأولي من المحور العصبي باستخدام مجهر الإضاءة ثلاثي الأبعاد (3D-SIM)
February 11th, 2022
يصف هذا البروتوكول طريقة لتصور وقياس حلقات الأكتين والمكونات الأخرى للهيكل العظمي الدوري للغشاء للجزء الأولي من المحور العصبي باستخدام الخلايا العصبية الحصينية للفئران المستزرعة ومجهر الإضاءة ثلاثي الأبعاد (3D-SIM).
يسمح هذا البروتوكول بحل الهيكل العظمي الدوري للغشاء في الجزء الأولي من المحور العصبي من الخلايا العصبية المستزرعة. من خلال فحص توطين البروتينات ، يمكن الحصول على نظرة ثاقبة في الوظيفة في الهيكل العظمي الدوري للغشاء. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي قوتها وسهولة استخدامها.
المجهر المنظم للإضاءة قادر على حل الهيكل العظمي الدوري للغشاء وإعداد العينة سهل ومباشر. يمكن لأي شخص لديه خبرة سابقة في الفحص المجهري الفلوري تنفيذ هذه التقنية بسهولة. تم تصميم هذا البروتوكول لزيادة نسبة الإشارة إلى الضوضاء أثناء إعداد العينة وتصويرها.
للبدء ، قم بإصلاح الخلايا العصبية باستخدام 4٪ Paraformaldehyde لمدة 12 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. اغسل الغطاء مرة واحدة في 0.2٪ BSA في محلول عازل للفوسفات واحتضنه لمدة 10 دقائق في محلول 1٪ من Triton X في PBS في درجة حرارة الغرفة. اغسل زلة الغطاء باستخدام BSA في محلول عازل للفوسفات ، وقم بتخفيف الأجسام المضادة المضادة ل ankyrin G باستخدام BSA في محلول عازل للفوسفات بنسبة واحدة إلى 200.
أضف محلول الأجسام المضادة إلى الغطاء واحتضنه بين عشية وضحاها عند أربع درجات مئوية. اغسل الخلايا مرة واحدة في محلول BSA العازل للفوسفات مرة واحدة في 0.1٪ Triton X في محلول الفوسفات العازل ومرة واحدة في محلول الفوسفات العازل. تمييع الفلورو 4 الموسومة ، إضافة المزيد من الأجسام المضادة الثانوية في محلول العازلة الفوسفات BSA وإضافة إلى زلة الغطاء.
اغسل الخلايا مرة واحدة في محلول BSA العازل للفوسفات مرة واحدة في 0.1٪ Triton X في محلول الفوسفات العازل ، ثم مرة واحدة في محلول الفوسفات العازل. تحضير محلول ميكرومولاري واحد من Ferodin الموسومة في محلول عازل الفوسفات وإضافته إلى الخلايا. اغسل الخلايا مرة واحدة في محلول الفوسفات العازل لألبومين مصل البقر مرة واحدة في 0.1٪ Triton X في محلول الفوسفات العازل ، ثم مرة واحدة في محلول الفوسفات العازل.
لتركيب الغطاء على شريحة زجاجية ، ضع قطرة من وسائط التركيب على شريحة ، واغمس الغطاء في الماء منزوع الأيونات ، واضغط عليه بمنشفة ورقية ناعمة لإزالة الماء الزائد. ضع الغطاء على الشريحة الزجاجية واحتضنه في درجة حرارة الغرفة لمدة 24 ساعة. إذا كان ذلك ممكنا ، استشر الموظفين من مرفق الفحص المجهري قبل التصوير واستخدم حاسبة زيت الغمر لاختيار زيت الغمر المناسب للعينة.
بمجرد أن تصبح العينات جاهزة ، تأكد من أن زلات الغطاء نظيفة وخالية من أي بقايا عن طريق تنظيفها بطرف قطني مغموس في الماء أو الإيثانول. ضع العينة في مجهر 3D-SIM وابحث عن الخلية لالتقاط الصورة. اضبط قوة خطوط الليزر ذات الصلة.
وأوقات التعرض لزيادة نسبة الإشارة إلى الضوضاء إلى أقصى حد دون تبييض العينة بشكل كبير. اضبط الحدود العليا والدنيا للعينة في البعد Z وتابع للحصول على مكدس. قم بتشغيل خوارزمية إعادة الإعمار على المكدس للحصول على إعادة بناء فائقة الحل.
تحقق من عمليات إعادة الإعمار بحثا عن القطع الأثرية المعروفة وإذا لزم الأمر ، اضبط المعلمات لتصحيحها. قارن إعادة بناء بطاقة SIM بصورة واسعة المجال لمراقبة التحسينات في الدقة. عند إجراء الفحص المجهري للإضاءة المنظمة متعددة الألوان ، استخدم خوارزمية المحاذاة لمحاذاة القنوات المختلفة بشكل صحيح ، بمجرد أن تصبح إعادة الإعمار مرضية جاهزة.
حلقات الأكتين في الهيكل العظمي الدوري للغشاء لها مظهر دوري مميز. قم بإنشاء صورة إسقاط بأقصى كثافة في برنامج تحليل الصور باستخدام جميع المستويات البؤرية حيث تكون حلقات الأكتين مرئية. في صورة الإسقاط ذات الكثافة القصوى ، ارسم خطا عموديا عبر الحلقات المجاورة المرئية وسجل كثافة التألق جنبا إلى جنب مع وظيفة ملف تعريف مخطط الخط في البرنامج.
لحساب متوسط المسافة بين الذروة، لاحظ الحد الأقصى المحلي في ملف تعريف الخط وقم بقياس المسافة بين قمم كثافة الفلورسنت الفردية المجاورة. لتقييم التوطين المشترك للبروتينات المختلفة مع حلقات الأكتين في الهيكل العظمي الدوري للغشاء ، قم بإجراء تحليل التوطين المشترك على إعادة بناء SIM للأكتين والبروتين المرشح. ارسم يدويا اختيارا لتحديد المقطع الأولي للمحور العصبي كمنطقة ذات أهمية ، للحصول على المكون الإضافي سهل التوطين في النظام الأساسي للبرنامج ، وقم بتشغيل التحليل لحساب معامل ارتباط بيرسون للتوطين المشترك.
أثناء تحليل صورة SIM ، أظهرت عمليات إعادة بناء مكدسات الصور دورية واضحة لحلقات الأكتين. تم استخدام جسم مضاد مضاد ل ankyrin G لتصور ankyrin G.تم اختبار التوطين المشترك لحلقات ankyrin G والأكتين في الجزء الأولي من المحور العصبي باستخدام إجراء تحليل colocalization لحساب معامل ارتباط بيرسون. كان معامل ارتباط بيرسون للتوطين المشترك لحلقات الأنكيرين G والأكتين الفلورية 0.36 زائد أو ناقص 0.03.
من الضروري استخدام زيت الغمر المناسب وضبط طاقة الليزر ووقت التعرض لجعل خطوط الشبكة مرئية. بمجرد تحديد أن البروتين هو جزء من الهيكل العظمي الدوري للغشاء ، يمكن التحقيق في وظيفته وتأسيسها في الحفاظ على الهيكل العظمي الدوري للغشاء. على سبيل المثال ، يمكن تحليل آثار هدم البروتين على حلقات الأكتين.
إن تطوير تقنيات الفحص المجهري فائق الدقة هو السبب في أننا نعرف أن الجزء الأولي للمحور العصبي يحتوي على هيكل عظمي دوري غشائي يتكون من حلقات الأكتين والطيف والأنكيرين. مكنت SIM الباحثين من تصور مكونات الهيكل العظمي الدوري للغشاء بسهولة والنظر إلى حلقات الأكتين في الخلايا الحية.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
نظرة عامة
تحدد هذه الدراسة بروتوكولًا لتصور وقياس حلقات الأكتين داخل الهيكل الدوري للغشاء في الجزء الأولي من المحور العصبي باستخدام الخلايا العصبية المخية للفئران المزروعة ومجهر الإضاءة المنظمة ثلاثية الأبعاد (3D-SIM). تتيح هذه التقنية للباحثين استكشاف توطين البروتينات، مما يعزز فهم وظيفة الهيكل الدوري للغشاء.
مكونات الدراسة الرئيسية
مجال العلم
- علم الأعصاب
- علم الأحياء الخلوية
- تقنية المجهر
الخلفية
- الجزء الأولي من المحور العصبي حاسم للإشارات العصبية.
- تلعب حلقات الأكتين دورًا مهمًا في الحفاظ على الهيكل الدوري للغشاء.
- يعزز المجهر ذو الإضاءة المنظمة الدقة في تصوير العينات البيولوجية.
- يوفر فهم توطين البروتينات رؤى حول أدوارها الوظيفية.
غرض الدراسة
- لتأسيس بروتوكول موثوق لتصوير حلقات الأكتين في الخلايا العصبية المزروعة.
- لتوضيح مكونات الهيكل الدوري للغشاء.
- لتسهيل تحليل التوطين المشترك للعديد من البروتينات في الجزء الأولي من المحور العصبي.
الطرق المستخدمة
- استخدام مجهر الإضاءة المنظمة ثلاثية الأبعاد لتصوير.
- كان النموذج البيولوجي الرئيسي عبارة عن خلايا عصبية مخية للفئران مزروعة.
- لم يتم ذكر مسارات عمل متعدد النظم في النص.
- تضمنت الخطوات الحاسمة التثبيت، وترطيب الأجسام المضادة، وإعداد التصوير.
- تم إجراء تحليل للصور لتقييم دورية حلقات الأكتين والتوطين المشترك للبروتين.
النتائج الرئيسية
- مكن البروتوكول من تصور حلقات الأكتين مع دورية مميزة.
- تم قياس التوطين المشترك للأنكيرين G وحلقات الأكتين، مما أسفر عن معامل بيرسون بنسبة 0.36 ± 0.03.
- يدعم تحديد حلقات الأكتين دورها في الهيكل الدوري للغشاء.
- سمح SIM بتحسينات واضحة في الدقة مقارنة بطرق التصوير التقليدية واسعة المجال.
الاستنتاجات
- توضح الدراسة طريقة قوية لتحليل الهيكل الدوري للغشاء في الخلايا العصبية.
- تسهم تقنيات التصوير المحسنة في فهم التركيب الخلوي في الخلايا العصبية.
- توفر الرؤى من هذا البحث أساسًا لاستكشاف المستقبل لوظائف البروتينات العصبية وآثارها في الصحة والمرض.
الأسئلة المتداولة
Executive Industry Relevance
Understanding the structural organization of the axon initial segment's membrane periodic skeleton supports target validation in neuroscience drug discovery by clarifying the spatial context of ion channels and scaffolding proteins. This mechanistic insight enables predictive de-risking of therapeutic hypotheses related to neuronal excitability disorders. The method enhances confidence in target engagement studies by providing quantitative spatial data on protein localization within a disease-relevant subcellular compartment.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by resolving the nanoscale architecture of the axon initial segment membrane periodic skeleton.
- Operational Value: Provides a robust, accessible super-resolution method for validating target localization in neuronal models.
- Predictive Value: Supports mechanistic de-risking through quantitative assessment of protein periodicity and colocalization with actin rings.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates quantitative fluorescence intensity profiles and Pearson's correlation coefficients for assessing protein-actin ring spatial relationships.
- Operational Value: Delivers reproducible, standardized imaging workflows compatible with multi-well neuronal culture formats.
- Assay Readiness: Produces super-resolved reconstructions that enable reliable detection of subcellular protein localization patterns.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Links molecular target localization to functional maintenance of the membrane periodic skeleton in a disease-relevant neuronal system.
- Mechanistic De-risking: Clarifies whether candidate proteins are structural components of the axon initial scaffold, informing target selection for neuropsychiatric indications.
- Predictive Confidence: Supports go/no-go decisions by determining if a protein is part of the periodic skeleton prior to functional validation.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the early discovery continuum, supporting target validation through subcellular resolution and enabling progression to mechanistic studies in neuronal models.
- Discovery Biology: Facilitates hypothesis testing by determining if a protein exhibits periodic localization consistent with membrane periodic skeleton integration.
- Screening: Enables assay development for high-content analysis of protein localization patterns in fixed neuronal cultures.
- Analytics: Provides quantitative readouts including inter-peak distance measurements and colocalization coefficients for objective comparison across conditions.
- Translational Research: Connects molecular findings to structural integrity of the axon initial segment, a key determinant of neuronal polarity and signaling.
- Enterprise Reuse: Establishes a standardized imaging platform applicable to multiple targets across neuroscience discovery programs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Reduces mechanistic ambiguity by defining the nanoscale spatial organization of axon initial segment proteins.
- Operational Value: Offers ease of use and robustness, requiring only standard fluorescence microscopy experience and accessible super-resolution instrumentation.
- Strategic Value: Improves target selection confidence by validating subcellular localization before investing in functional assays.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of targets based on their integration into the axon initial segment scaffold.
Implementation Considerations
- Requires familiarity with fluorescence microscopy and super-resolution imaging principles.
- Dependent on access to 3D-SIM instrumentation and appropriate immersion oil optimization.
- Necessitates standardized antibody validation and blocking conditions to minimize nonspecific signal.
- Involves careful laser power and exposure calibration to balance signal-to-noise ratio with photobleaching.
- Applicable primarily to fixed neuronal cultures; live-cell applications require additional validation.
