استخدام الفحص المجهري 2-فوتون لتحديد آثار انسداد الحالب المزمن من جانب واحد على العمليات الكبيبية

في البيانات المقدمة في هذه الدراسة تظهر الآثار الدراماتيكية لانسداد الحالب من جانب واحد على وظائف الكلى والالتهابات والتليف. يساعدنا على فهم الآليات الفيزيولوجية المرضية لانسداد الحالب من جانب واحد. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي القدرة على دراسة تفاعلات الخلية والخلية ، والأحداث تحت الخلوية ، والبنية المرتبطة بها ووظيفتها بطريقة ديناميكية داخل كلية عاملة.

سيتم إجراء عملية الحالب من قبل الدكتورة سيلفيا كامبوس بيلدرباك وهي جراح في مختبرنا. للبدء ، قم بتخدير الفئران ، ثم قم بعمل شق على طول خط الوسط وحدد موقع الكلية اليسرى لفصلها عن الأعضاء البريتونية المحيطة. بعد تحديد موقع عنيق الكلى ، الذي يضم الشريان الكلوي والوريد الكلوي والحالب ، افصل الحالب دون الإضرار بالبنية الحساسة.

استخدم الملقط لحلقة وربط خياطة 3-0 حول الحالب ، ثم اربط عقدة بضعة ملليمترات على جانبي العقدة الأولى لضمان انسداد كامل. بمجرد ربط الحالب ، أغلق طبقات العضلات المتتالية بعناية ، ثم أغلق البطن تماما. أغلق الجلد الخارجي بدبابيس جراحية.

للتحضير الجراحي ، ضع الجرذ المخدر مع خط وصول وريدي ساكن على الجانب مع توجيه الجناح الأيسر المحلوق لأعلى بشكل مسطح ومستقيم على الطاولة. تأكد من أن الكفوف الأمامية للفأر تلمس بعضها البعض كما ينبغي أن الكفوف الخلفية. بمجرد وضع الجرذ ، اشعر بالجناح الأيسر أسفل الأضلاع مباشرة لتحسس الكلى وتحديد الوضع الطبيعي في البطن ، ثم ارسم خطا باستخدام علامة دائمة على طول منطقة الحلاقة ، مع تقسيم مركز الكلى في اتجاه من الأنف إلى الذيل.

استخدم زوجا من الملقط المسنن للإمساك بالجلد ورفعه لأعلى وقرص خط العلامة الدائم بزوج من مرقئ الدم لسحق الأوعية الدموية الأساسية ومنع النزيف. كرر الإجراء لطبقة العضلات الخارجية الرقيقة لتقليل النزيف. لعمل شق نهائي لطبقة عضلات البطن الداخلية الرقيقة ، قم بجس الكلى لتقدير الحجم والموضع ورفع طبقة العضلات الداخلية بزوج من الملقط ، ثم سحق خطا يقسم الجلد فوق الكلى باستخدام مرقئ يبلغ حوالي 1/3 الحجم المقدر للكلية.

مع الحفاظ على قبضة على طبقة العضلات مع ملقط ، قم بعمل شق نهائي. بعد ذلك ، استخدم ملقط في كل يد للإمساك بدهون الكلى والاحتفاظ بها في القطب السفلي من الكلى باستخدام تقنية اليد فوق اليد التي تعمل لأسفل. وجود قبضة قوية على الدهون بيد واحدة ، وسحب الدهون والضغط بلطف شديد على الكلى من خلال شق.

إذا لم تمر الكلى ، فقم بتوسيع الشق بسهولة. لتحديد خلايا الدم البيضاء أو كرات الدم البيضاء الموجودة في الحلقات الشعرية ، قم بإعطاء صبغة Hoechst 33342 النووية بمعدل 8 ميكروغرام لكل كيلوغرام من وزن الفئران عبر خط وصول وريدي ساكن. على المجهر ، ضع الكلية المكشوفة على حافة الطبق مع دوران طفيف بحيث يلامس الجانب البطني من الكلى زلة الغطاء والجانب الظهري متجها بعيدا عن الحافة.

لتقليل الحركة بشكل أكبر ، قم بتعبئة وسادتين شاشيتين معقمتين 2 × 2 مبللتين بمحلول ملحي على الجانب الظهري من الكلى مما يعزز ملامسة الجانب البطني من الكلى للحافة. عندما يتم وضع العينة ، انظر من خلال عدسة المجهر تحت إضاءة epifluorescence باستخدام مكعب rhodamine FITC مزدوج التمرير. إذا تم الكشف عن حركة في موضع العينة ، فقم بإجراء تعديلات طفيفة عن طريق ضبط الشاش لضمان عدم دفعه تحت الكلى.

لف الجرذ قليلا حتى يكون الصدر بعيدا عن الطبق. مسح سطح الكلى باستخدام إضاءة epifluorescence ووضع علامة على مواضع الكبيبات باستخدام البرنامج المرتبط بوحدة التحكم في المرحلة الآلية. لكل قناة ملونة تحت إضاءة 2-فوتون ، خذ حجم 3D ضحل للجزء العلوي من كل كبيبة مميزة لتكون بمثابة صورة الخلفية.

في خيار العرض لبرنامج التصوير ، استخدم لوحة ألوان زائفة لتصور الشدة الخافتة لمضان الخلفية للحلقات الشعرية الكبيبية. باستخدام وعاء دموي سطحي كنقطة محورية ، قم بضخ ألبومين مصل تكساس الأحمر RAP الفلوري أو TRRSA ببطء مع ملاحظة صعود وهبوط التألق بسبب التوزيع الجهازي حتى تكون الكثافة في الأوعية الدموية المحيطة بالحلقات الشعرية أقل بقليل من التشبع. بعد 10 دقائق ، احصل على وحدات تخزين 3D لجميع الكبيبات المميزة والمصورة على فترات 1 ميكرومتر.

ابحث عن وعاء مناسب ، إما حلقة شعرية أو وعاء محيطي ، ثم قم بتدوير الصورة باستخدام وظيفة Rotate لأن وظيفة Line Scan في برنامج الحصول على الصور تتطلب أن يكون الوعاء عموديا. بمجرد تدوير الوعاء ووضعه بشكل مسطح ، حدد وظيفة XT في قائمة الاستحواذ وقم بإعدادها لمسح 4000 خط. ضع الخط عبر الوعاء المراد فحصه بالمستوى البؤري عند أقصى قطر للقطعة.

بعد ذلك ، انقر بزر الماوس الأيسر على الصورة المركبة الملونة وحدد علامة التبويب Take Snapshot لإنشاء صورة مرجعية للمنطقة التي تم فيها إجراء مسح الخط. انقر على الفور فوق الزر "ابدأ" لالتقاط مسح خط السفينة. في وقت لاحق ، قم باستيراد مسح الخط إلى برنامج معالجة الصور لتحديد معدل تدفق RBC.

ضمن القائمة المنسدلة قياس، افتح مربع الحوار إظهار إحصائيات المنطقة وحدد أداة رسم سطر واحد لرسم خط يطابق ميل ظلال RBC. بعد ملاحظة عرض الخط وارتفاعه ، استخدم معادلة لحساب السرعة ، ثم احصل على متوسط خمس عمليات حسابية للإبلاغ عن السرعة لكل مسح للخط. توسيط الكبيبة في مجال التصوير واتخاذ مجموعة بيانات ثلاثية الأبعاد تبدأ من سطح الكبيبة وتنتهي من 30 إلى 35 ميكرومتر.

استخدم حجم خطوة 1 ميكرومتر في الاتجاه Z. حدد كرات الدم البيضاء من خلال مقارنة قناة Hoechst الزرقاء بقناة الألبومين الأحمر في تكساس من خلال البحث عن استبعاد الصبغة الحمراء في الحلقة الشعرية والبقعة النووية المقابلة. إذا ظهرت كرات الدم البيضاء ثابتة على ثلاثة أقسام بصرية ، فحدد الخلايا على أنها ملتصقة ، ثم أبلغ عن القيم على أنها تحدث لكل 10 أقسام بصرية من أعلى الكبيبة المأخوذة على فترات 1 ميكرومتر.

تم زيادة عدد الكبيبات لكل حقل في فئران ميونيخ Wistar Fromter أو MWF في مجموعة UUO لمدة 5 أسابيع مقارنة بالفئران غير المعالجة. انتقلت فئران Sprague-Dawley ، أو فئران SD ، من عدم وجود كبيبات سطحية إلى 2.02 لكل حقل بعد خمسة أسابيع من انسداد الحالب من جانب واحد. لوحظت صور ثلاثية الأبعاد أعيد بناؤها لعرض سطح الكلى.

لم ينتج عن انسداد الحالب أحادي الجانب لمدة 5 أسابيع في فئران SD مناطق تشبه الظهارة الأنبوبية الطبيعية كما هو موضح في MWF ، غير المعالجة ، وجزئيا في فئران UUO MWF لمدة 5 أسابيع. في دراسة ديناميكيات الأوعية الدموية الكلوية ، انخفض تدفق الدم الكلوي بشكل كبير في مجموعات UUO MWF لمدة 5 أسابيع ، ومجموعات SD مقارنة بالفئران غير المعالجة. انخفضت سرعة كرات الدم الحمراء داخل الحلقات الشعرية الكبيبية بشكل ملحوظ في فئران UUO MWF لمدة 5 أسابيع ، وفئران SD مقارنة بفئران MWF غير المعالجة.

بالإضافة إلى ذلك ، كان لدى فئران MWF غير المعالجة عدد أقل من كرات الدم البيضاء لكل 10 أقسام بصرية من الأعلى بينما زاد العدد في 5 أسابيع UUO MWF و 5 أسابيع من فئران UUO SD. مع انسداد الحالب من جانب واحد ، لوحظت زيادة في نفاذية الألبومين. كان تراكم الألبومين داخل مساحة بومان شديدا بعد انسداد الحالب من جانب واحد.

الجزء S1 endocytosis كميات كبيرة من الألبومين كما لوحظ مع الظروف الفسيولوجية في الفئران MWF غير المعالجة. لا يمكن رؤية نفس الامتصاص في الفئران MWF أو SD بعد 5 أسابيع من انسداد الحالب من جانب واحد. يمكن إجراء العديد من الطرق المختلفة مثل التصوير المتكرر لدراسة عملية بمرور الوقت ، وتثبيت منطقة معينة للتصوير ، والاستخدام اللاحق للأنسجة الثابتة لإجراء فحص مجهري عالي الدقة بالتزامن مع هذه التقنية.

تعتبر هذه التقنية تقنية تخريبية. يتم تمكين المحققين من الإجابة على العديد من الأسئلة الجديدة. وبذلك، تم تقديم رؤى جديدة وتم الحصول على بيانات تغيير النماذج.