القياس الكمي لأنواع الأكسجين التفاعلية باستخدام مسبار ثنائي أسيتات ثنائي كلورو الفلوريسين ثنائي كلورو فلوريسين 2′,7′ وقياس التدفق الخلوي في خلايا مولر الدبقية
مايو 13, 2022
هنا ، نقترح بروتوكولا منهجيا ويمكن الوصول إليه وقابلا للتكرار للكشف عن أنواع الأكسجين التفاعلية الخلوية (ROS) باستخدام مسبار ثنائي أسيتات ثنائي كلورو فلوروريسين ثنائي الفلور 2′,7′ (DCFH-DA) في خلايا مولر الدبقية (MGCs). تحدد هذه الطريقة إجمالي مستويات ROS الخلوية باستخدام مقياس التدفق الخلوي. هذا البروتوكول سهل الاستخدام للغاية ومناسب وقابل للتكرار.
هناك عدة طرق لقياس إنتاج ROS ، أو الإجهاد التأكسدي في الخلايا. من بين هذه ، 2'7'dichlorofluorescein ثنائي أسيتات التحقيق هي واحدة من أكثر التقنيات استخداما على نطاق واسع لقياس حالة الأكسدة والاختزال مباشرة. هذا المسبار محب للدهون وغير فلورسنت. يسمح انتشار هذا المسبار عبر غشاء الخلية بانقسام الإستراز داخل الخلايا في رابطتي الإستر ، مما ينتج منتجا قطبيا نسبيا وغير منفذ بغشاء الخلية. تتراكم هذه الجزيئات غير الفلورية داخل الخلايا ، وتنتج الأكسدة اللاحقة بواسطة ROS المنتج عالي الفلورسنت ثنائي كلورو فلوريسين. أكسدة المسبار هي نتاج عمل أنواع متعددة من ROS. والتي يمكن اكتشافها عن طريق قياس التدفق الخلوي أو المجهر البؤري. في هذه المقالة ، استخدمنا مسبارا ثنائي أسيتات ثنائي كلورو فلوريسين لقياس وقياس ROS عن طريق قياس التدفق الخلوي. انقل لوحات 6 آبار إلى غطاء تدفق صفائحي من الحاضنة. شفط السوبرناتانت. واغسل الخلايا مرة واحدة باستخدام PBS. أضف 2 مل من مصل DMEM منخفض لكل بئر. واحتضن لوحة 6 بئر لمدة ساعتين في الحاضنة. علاج الخلايا مع مضادات الأكسدة لمدة ست ساعات. عالج الخلايا باستخدام محفز ROS ، A أو B ، لمدة 30 دقيقة. شفط السوبرناتانت. واغسل الخلية ثلاث مرات باستخدام PBS لإزالة جميع المحفزات. أطفئ ضوء غطاء التدفق الرقائقي واعمل في الظلام. أضف 1 مل من مسبار ثنائي أسيتات ثنائي كلورو فلوريسين في DMEM بدون الفينول الأحمر. أضف 1 مل من DMEM بدون الفينول الأحمر إلى خلايا التحكم في التألق الذاتي. احتضن لوحة 6 بئر لمدة 30 دقيقة في الحاضنة. انقل الألواح على الجليد إلى المختبر. اغسل الخلايا ثلاث مرات مع 2 مل من PBS البارد لكل بئر. أضف 0.5 مل من المخزن المؤقت المنفصل البارد إلى كل بئر. حصاد الخلايا عن طريق السحب بلطف لأعلى ولأسفل باستخدام ماصة P1000. اجمعها في أنبوب 1.5 مل. وقم بطردها مركزيا عند 600 × g لمدة خمس دقائق عند 4 C.تخلص من supernatant بعناية ، وافصل الحبيبات بلطف مع التنصت. أضف 1 مل من المخزن المؤقت FACS لغسل الخلايا إلى كل أنبوب ملصق. إذا لزم الأمر ، استخدم الدوامة بأقل كثافة للانفصال الكامل للبيليه. قم بطردها مركزيا عند 600 × g لمدة خمس دقائق عند 4 C.كرر هذه الخطوة مرتين أكثر. ثلاث غسلات في المجموع. أعد تعليق كريات الخلايا في 200 لتر من المخزن المؤقت FACS. افصل بلطف الكريات تماما في كل أنبوب باستخدام الدوامة. ونقل إلى 5 مل المسمى لأنابيب التدفق الخلوي. احتفظ بالأنابيب على الجليد حتى يتم تحليلها على مقياس التدفق الخلوي. باستخدام برنامج قياس التدفق الخلوي ، قم بإنشاء تجربة جديدة. انقر فوق العينة وسيقوم بفتح قائمة بالأنابيب. انقر نقرا مزدوجا فوقها وأعد تسميتها. ضع أنبوب التحكم في التألق الذاتي على ذراع الشافط، مع تحريك القاعدة بعناية إلى اليسار فقط. انقر فوق الحصول على البيانات ثم فوق تسجيل البيانات، وحدد شرط الإيقاف المطلوب. ارسم بوابة حول الخلايا المثيرة للاهتمام ، باستثناء الخلايا الميتة والحطام. قم بإزالة الأنبوب. انقر فوق الأنبوب التالي وقم بتشغيل نموذج التحكم الأساسي. انقر فوق الحصول على البيانات ثم في سجل البيانات.افتح البرنامج. أضف العينات باستخدام زر الإجراء إضافة عينات. انقر فوق إضافة عينة.حدد مجلد التاريخ التجريبي وانقر فوق اختيار.انقر نقرا مزدوجا فوق العينة الأولى في مساحة العمل، عنصر تحكم التألق التلقائي في هذه الحالة. ارسم بوابة مضلع لعزل الخلية ذات الأهمية ، باستثناء الخلايا الميتة والحطام. تغيير المؤامرة إلى رسم بياني. انقر نقرا مزدوجا داخل M
اعرض النص الكامل واحصل على الوصول إلى آلاف الفيديوهات العلمية
نظرة عامة
تقدم هذه الدراسة بروتوكولاً للكشف عن مستويات أنواع الأكسجين التفاعلية (ROS) الخلوية باستخدام مسبار 2′,7′-dichlorofluorescein diacetate (DCFH-DA) في خلايا مولر الدبقية (MGCs). وقد صُممت هذه الطريقة لتكون ميسرة وقابلة للتكرار، وهي تعمل على قياس ROS كمياً باستخدام قياس التدفق الخلوي.
مكونات الدراسة الرئيسية
مجال العلوم
- البيولوجيا الخلوية
- الإجهاد التأكسدي
- علوم الأعصاب
خلفية علمية
- تلعب أنواع الأكسجين التفاعلية (ROS) دوراً حاسماً في مختلف العمليات الخلوية.
- يعد قياس ROS أمراً ضرورياً لفهم الإجهاد التأكسدي في الخلايا.
- يعد مسبار DCFH-DA طريقة مستخدمة على نطاق واسع للكشف عن ROS.
- يركز البروتوكول على قابلية التكرار وسهولة الاستخدام.
الغرض من الدراسة
- توفير بروتوكول واضح للكشف عن أنواع الأكسجين التفاعلية (ROS) في خلايا مولر الدبقية.
- تمكين القياس الكمي للإجهاد التأكسدي في الخلايا العصبية.
- تسهيل الأبحاث المتعلقة بدور أنواع الأكسجين التفاعلية (ROS) في الوظائف الدبقية والبيولوجيا العصبية.
الطرق المستخدمة
- تم إجراء زراعة خلوية لخلايا مولر الدبقية لإنشاء النموذج البيولوجي.
- عُولجت الخلايا بمضادات الأكسدة ومحفزات ROS لتقييم مستويات ROS.
- استُخدم مسبار DCFH-DA للكشف عن ROS وتم قياسه كمياً باستخدام قياس التدفق الخلوي.
- تضمنت الخطوات الحرجة غسل الخلايا بمحلول PBS والتحكم في التعرض للضوء أثناء المقاييس.
النتائج الرئيسية
- قاس البروتوكول بفعالية مستويات ROS الخلوية في خلايا مولر الدبقية.
- وفر قياس التدفق الخلوي تحليلاً كمياً لتراكم ROS.
- أكدت النتائج جدوى استخدام مسبار DCFH-DA تحت ظروف محددة.
الاستنتاجات
- تضع هذه الدراسة طريقة موثوقة لتقييم الإجهاد التأكسدي في الخلايا الدبقية.
- يؤدي هذا البروتوكول إلى تبسيط قياس أنواع الأكسجين التفاعلية (ROS)، مما يعزز إمكانية وصول الباحثين إليها.
- تترتب على هذه النتائج آثار هامة لفهم الإجهاد التأكسدي في البيولوجيا العصبية والأهداف العلاجية المحتملة.
الأسئلة الشائعة
الأهمية الصناعية التنفيذية
يتيح القياس الكمي لأنواع الأكسجين التفاعلية (ROS) في خلايا مولر الدبقية باستخدام DCFH-DA وقياس التدفق الخلوي تقييماً قوياً لآليات الإجهاد التأكسدي ذات الصلة بنماذج الأمراض التنكسية العصبية وأمراض الشبكية. وتدعم هذه القدرة التحقق من الأهداف في المراحل المبكرة وتقليل المخاطر الميكانيكية لتعديل مسارات مضادات الأكسدة. كما يوفر القياس الكمي الموثوق لـ ROS بيانات أساسية لاتخاذ قرارات بشأن الجزيئات المرشحة التي تستهدف التوازن التأكسدي في الأنظمة ذات الصلة بالمرض.
التطبيقات الاستراتيجية في البحث والتطوير في مجال الأدوية الحيوية
الاكتشاف المبكر والتحقق من صحة الهدف
- يتيح استقصاء تنشيط مسار مضادات الأكسدة وتعديل حالة الأكسدة والاختزال في نماذج الخلايا الدبقية.
- يدعم التحقق الوظيفي من الأهداف المشاركة في الإجهاد التأكسدي وآليات الدفاع الخلوي.
- يوفر تقييماً ميكانيكياً لتقليل المخاطر فيما يتعلق بالتدخلات المرشحة التي تؤثر على مستويات ROS.
الفحص وتطوير المقايسة
- يسهل تحضير أنظمة خلوية مصادق عليها لفحص المركبات مقابل نقاط النهاية للإجهاد التأكسدي.
- يقدم قراءات كمية ومعيارية لأنواع الأكسجين التفاعلية (ROS) مناسبة لإعادة إنتاج الاختبار والمقارنة بين الدراسات المختلفة.
- يتيح تقييماً موثوقاً لتأثيرات المركبات المضادة للأكسدة أو المحفزة للأكسدة بتنسيق قابل للتوسع.
الأبحاث الانتقالية وما قبل السريرية
- يتماشى مع النماذج ذات الصلة بأمراض الشبكية التي تنطوي على الإجهاد التأكسدي، مثل اعتلال الشبكية السكري.
- يدعم الاستمرارية الانتقالية من خلال ربط تعديل أنواع الأكسجين التفاعلية (ROS) في المختبر باستراتيجيات المؤشرات الحيوية قبل السريرية.
- يوفر بيانات لتطوير المرشحات المضادة للأكسدة مع تعديل المخاطر بناءً على النتائج الخلوية الكمية.
تكامل مسارات العمل وسير العمل
يأتي سير عمل تقدير كمية ROS هذا ضمن مرحلة الاكتشاف المبكر وصولاً إلى تحديد المركبات الرائدة، مما يدعم كلاً من اختبار الفرضيات وتكامل عمليات الفرز اللاحقة.
- بيولوجيا الاكتشاف: توفر أدلة كمية على مشاركة مسار الأكسدة والاختزال والاستجابة الخلوية للإصابات التأكسدية.
- الفحص الممنهج: توفر قياسات لأنواع الأكسجين التفاعلية (ROS) قابلة للتكرار تعتمد على قياس التدفق الخلوي لفرز المركبات.
- التحليلات: تتيح المقارنة الإحصائية لمستويات ROS عبر الظروف التجريبية باستخدام المتوسط الهندسي لشدة الفلورة.
- الأبحاث الترجمية: تربط بين تعديل الإجهاد التأكسدي في المختبر والنقاط النهائية ذات الصلة بالمرض في نماذج الشبكية.
- إعادة الاستخدام المؤسسي: تؤسس منصة قياسية لفحص ROS قابلة للتكيف مع أنواع مختلفة من الخلايا وعوامل تعديل الأكسدة والاختزال.
التأثير التشغيلي والمؤسسي
- القيمة العلمية: تزيد من الثقة التنبؤية في الاكتشافات المستهدفة للأكسدة والاختزال وتحد من الغموض الميكانيكي.
- القيمة التشغيلية: توفر قياساً كمياً معيارياً وقابلاً للتوسع والتكرار لأنواع الأكسجين التفاعلية (ROS) لسير العمل المشترك بين الفرق.
- القيمة الاستراتيجية: تحسن قرارات المتابعة أو الإيقاف (go/no-go) لمعدلات مسارات مضادات الأكسدة وتعزز كفاءة رأس المال.
- تأثير المحفظة: تدعم تحديد الأولويات المعدلة حسب المخاطر للمرشحين الذين يستهدفون آليات الإجهاد التأكسدي.
اعتبارات التنفيذ
- يتطلب خبرة في تشغيل قياس التدفق الخلوي وتحليل البيانات.
- يتطلب الوصول إلى أجهزة قياس التدفق الخلوي وبرامج التحليل المتوافقة.
- يستلزم توحيد معايير بروتوكولات تحديد البوابات (gating) وتقدير كمية الفلورة بين الفرق المختلفة.
- قابل للتكيف مع نماذج خلوية أخرى مع تحسين البروتوكول لتحميل المسبار وعناصر التحكم.
- يعتمد على التعامل الدقيق مع العينات لتقليل التباين في المقايسة والشوائب الناتجة عن الضوء.
