استكشاف استقلاب طاقة الميتوكوندريا من كرويات الأنسجة الدقيقة 3D واحدة باستخدام تحليل التدفق خارج الخلية

يسمح بروتوكولنا للباحثين بالتحقيق في استقلاب طاقة الميتوكوندريا والكرويات السلسة للسماح بإجراء مقارنات بين العديد من خطوط الخلايا المختلفة وأرقام الخلايا والأنماط الظاهرية ، بالإضافة إلى العلاجات الدوائية في اكتشاف الأدوية الميدانية وأبحاث السرطان. يقدم عملنا بروتوكولا مفصلا لاستكشاف استقلاب طاقة الميتوكوندريا باستخدام كرويات 3D التي توفر النموذج الفسيولوجي المتفوق مقارنة بتجارب الطبقة الأحادية الخلية. يمكن أن تكون الملاحظات البيولوجية استقراء من الكرويات الزجاجية إلى الأورام في الجسم الحي وتحديد المسارات التي قد تستهدف استقلاب الورم الكروي.

على سبيل المثال ، فائدة الكربوهيدرات أثناء نمو الكرويات. جميع البيانات فرس البحر تدفق خارج الخلية 96 أداة حساسة للغاية. يعد تحديد المواقع في الكرويات المخبرية داخل لوحة الفحص أمرا بالغ الأهمية للحصول على بيانات دقيقة على مستوى كروي واحد.

تحقق من الجدوى الكروية باستخدام مجهر ضوئي مقلوب مع تباين الطور عند تكبير 4x لضمان بنية كروية سليمة ومورفولوجيا وتوحيد عام بين العينات. لترطيب خرطوشة المستشعر ، قم بإدخال ما يقرب من 20 ملليلتر من المعايرة في أنبوب مخروطي. ضع الأنبوب المخروطي الذي يحتوي على المعايرة في حاضنة غير ثاني أكسيد الكربون 37 درجة مئوية بين عشية وضحاها.

أخرج محتويات مجموعة الفحص. ضع خرطوشة المستشعر رأسا على عقب بجوار لوحة الأداة المساعدة. ماصة 200 ميكرولتر من الماء المقطر المزدوج المعقم في كل بئر من لوحة المرافق باستخدام ماصة P300 متعددة القنوات.

ضع خرطوشة المستشعر أعلى لوحة الأداة المساعدة. تحقق مما إذا كان مستوى المياه في كل بئر مرتفعا بما يكفي لغمر مجسات الاستشعار. انقل خرطوشة المستشعر المجمعة إلى حاضنة غير ثاني أكسيد الكربون 37 درجة مئوية واتركها طوال الليل.

لطلاء الصفيحة الدقيقة للفحص الكروي ، أضف 30 ميكرولتر من 0.1 ملليغرام معقمة لكل محلول بولي دي ليسين لكل بئر من الصفائح الدقيقة الكروية باستخدام تقنية الصرف الصحي. قم بشفط المحلول من كل بئر من الصفيحة الدقيقة الكروية ، وعكس اللوحة ، واضغط عليها بقوة على المناديل الورقية لإزالة أي محلول متبقي. اغسل كل بئر من الطبق ب 200 ميكرولتر من الماء المقطر المزدوج المعقم.

بعد الغسيل النهائي ، اقلب الصفيحة الدقيقة واضغط عليها بقوة على المناديل الورقية لإزالة أي ماء متبقي. اترك الطبق حتى يجف في الهواء لمدة 30 دقيقة قبل الاستخدام في المستقبل. قم بإعداد وسيط XF RPMI كما هو موضح في المخطوطة.

قم بتسخين فحص XF RPMI المكمل بدرجة حرارة متوسطة إلى 37 درجة مئوية قبل ساعة واحدة من الفحص. وقم بتسخين الصفيحة الكروية المطلية في حاضنة غير ثاني أكسيد الكربون 37 درجة مئوية. أخرج الأنبوب المخروطي الذي يحتوي على المعايرة وخرطوشة المستشعر من حاضنة الهواء.

قم بإزالة خرطوشة المستشعر من لوحة الأداة المساعدة وضعها رأسا على عقب على سطح العمل. باستخدام ماصة P300 متعددة القنوات ، استنشق الماء من لوحة المرافق وتخلص منها. أضف 200 ميكرولتر من المعايرة المسخنة مسبقا إلى كل بئر من لوحة المرافق.

ضع خرطوشة المستشعر على لوحة الأداة المساعدة لضمان غمر المستشعرات جيدا في المعايرة. انقل خرطوشة المستشعر المجمعة إلى حاضنة غير ثاني أكسيد الكربون ، 37 درجة مئوية حتى تصبح جاهزة لتحميل حلول حقن المنفذ. أخرج لوحة الثقافة الكروية من الحاضنة وراقب الكرويات تحت المجهر لضمان سلامتها قبل خطوات النقل الكروية.

قم بتحميل 180 ميكرولتر من متوسط فحص ما قبل الاحترار في كل بئر من اللوحة الكروية بما في ذلك أي آبار تصحيح خلفية. املأ جزئيا طبق بتري بطول سبعة سنتيمترات بثلاثة ملليلترات من وسط الفحص. انقل الكرويات من طبق الاستزراع البئري 96 إلى طبق بتري ، باستخدام ماصة متعددة القنوات محملة بأطراف ماصة فتحة واسعة ، وحجم مضبوط على 10 إلى 50 ميكرولتر.

اضبط حجم ماصة أحادية القناة مزودة بطرف ماصة فتحة عريضة على 20 ميكرولتر وقم بشفط كروي واحد بعناية. ضع الطرف مباشرة في وسط كل بئر من هذه الصفيحة الدقيقة للفحص الكروي واسمح للعمل الشعري بسحب الكروية من طرف الماصة. تأكد من التطور تحت المجهر عن طريق سحب محتويات الماصة مرة أخرى إلى طبق بتري.

بمجرد نقل كل هذه الكرويات إلى الصفيحة الدقيقة للفحص الكروي ، انقل اللوحة إلى حاضنة غير ثاني أكسيد الكربون 37 درجة مئوية لمدة لا تقل عن ساعة واحدة. قم بإعداد تركيزات مخزون العمل لكل مركب كما هو موضح في المخطوطة، باستخدام وسيط فحص XF RPMI مستكمل بالكامل مسبقا. توزيع 20 ميكرولتر من محلول العمل لكل مركب في جميع المنافذ المقابلة باستخدام ماصة P100 متعددة القنوات معايرة.

قم بإعداد المحلل لتحميل خرطوشة المستشعر. للحصول على كرويات مدمجة جيدة التكوين ، تم تحسين كل خط خلية بشكل فردي لكثافة البذر ومدة الزراعة. في استراتيجيات البذر المحسنة ، كان حجم الكروي ل SK-OV-3 حوالي 5.46 × 10 إلى سبعة ميكرومترات مكعبة وبالنسبة ل A549 ، كان 1.45 × 10 إلى ثمانية ميكرومتر مكعب.

كان لجميع الأنواع الكروية علاقة خطية بين كثافة البذر الأولية والحجم الكروي. كان للتماثل الكروي المثالي دائرية 1.0 والانحراف عن 1.0 يشير إلى فقدان الدائرية. بالنسبة لجميع الأنواع الكروية ، زاد معدل استهلاك الأكسجين مع حجم كروي وكان مرتبطا خطيا بالحجم الكروي مع أعلى في الكرويات MCF-7 وأدنى معدل في الكرويات SK-OV-3.

لم تستجب الكرويات MCF-7 للتحكم في السيارة طوال التجربة. تم تخفيض معدل استهلاك الأكسجين في الكرويات MCF-7 مع oligomycin بعد خمس دورات قياس بعد الحقن الأول من 0.5 ميكروغرام لكل ملليلتر. استجابة ل BAM15 ، تم زيادة معدل استهلاك الأكسجين قبل الحقن الثاني.

في حين أن مزيج من Rotenone بالإضافة إلى Antimycin A خفضه. بروتوكول للتحقيق بدقة في تنفس الميتوكوندريا القاعدية. تم تطوير التنفس الفسفري ADP ، تنفس التسرب ، كفاءة الاقتران ، القدرة التنفسية القصوى ، والقدرة التنفسية الاحتياطية باستخدام كرويات 3D المشتقة من السرطان.

وأسفرت جميع المركبات التنفسية عن ملامح معدل استهلاك الأكسجين الحركي المتوقع للمركبات المختارة التي تكشف عن متوسط معدل ثابت للتنفس القاعدي يتراوح بين 20 و 30 بيكومول من الأكسجين في الدقيقة لكل بئر. موقع الكرويات داخل الصفائح الدقيقة ورقم دورة القياس بعد الحقن المركب لضمان استقرار معدلات التنفس بين الإضافات المركبة. عند استكشاف القدرة التنفسية للميتوكوندريا مع غير المقترنات ، ليس فقط مفتاح التركيز ولكن أيضا قدرته على فصل التنفس في وجود oligomycin، والذي يضاف عادة قبل فك الاقتران في التجارب التي تحقق في استقلاب طاقة الميتوكوندريا.