عزل الخلايا الجذعية الوسيطة للأنسجة الدهنية للفئران للتمايز إلى خلايا منتجة للأنسولين
أغسطس 29, 2022
يمكن أن تكون الخلايا الجذعية الوسيطة المشتقة من الأنسجة الدهنية (Ad-MSCs) مصدرا محتملا ل MSCs التي تتمايز إلى خلايا منتجة للأنسولين (IPCs). في هذا البروتوكول ، نقدم خطوات مفصلة لعزل وتوصيف الفئران البربخية Ad-MSCs ، متبوعة ببروتوكول بسيط وقصير لتوليد IPCs من نفس الفئران Ad-MSCs.
الهدف العام من هذا البروتوكول هو عزل وتوصيف الأنسجة الدهنية الحمراء والخلايا الجذعية الوسيطة المجففة وتمييزها نحو الخلايا المنتجة للأنسولين باستخدام طرق بسيطة. وقد وجدت الخلايا الجذعية الوسيطة الطرق في مجال علم الوراثة. يمكن عزلها من مصادر مختلفة مثل نخاع العظام والأنسجة الدهنية والأنسجة المحيطة بالولادة.
إنهم يقبلون الخصائص الثقافية الممتازة. فهي متعددة القدرات ويمكن أن تعالج الأمراض المختلفة. توفر الأنسجة الدهنية مصدرا غنيا للخلايا الجذعية الوسيطة.
يمكن عزل هذه MSCs الدهنية من شفط الدهون بسهولة مع غلة عالية مقارنة بمصادر أخرى مثل نخاع العظام. ويمكن أن توفر مصدرا جيدا لكل من الزرع الذاتي والوجيني. في هذا الفيديو ، يتم تقديم بروتوكول بسيط لعزل وتوصيف الخلايا الجذعية الوسيطة الدهنية من الدهون البربخية للفئران.
هذا الإجراء هو طريقة بسيطة عالية الكفاءة للعزل. بعد العزلة ، سنتحمل تمايز هذه الخلايا الجذعية الوسيطة الدهنية إلى خلايا منتجة للأنسولين باستخدام بروتوكول بسيط وقصير نسبيا. سنبدأ بعزل الخلايا الجذعية الوسيطة الدهنية عن طريق هضم الكولاجين للدهون البربخية للحصول على جزء وعائي أقوى.
ثم ستتميز الخلايا الجذعية الوسيطة بالالتصاق البلاستيكي ، وكذلك التعبير عن علامات CD والتمايز إلى سلالات متعددة من الجلد المتوسط. Anaesthise الحيوان ، ثم القتل الرحيم باستخدام خلع عنق الرحم. رش في جميع أنحاء الجسم مع 70 ٪ من الإيثانول والبدء مع استئصال الجلد والعضلات في الجزء السفلي من البطن.
ثم فضح الخصيتين بالدهون البربخية. قطع بلطف الدهون البربخ. احرص على عدم قطع الأوعية الدموية بالدهون.
في خزانة السلامة الحيوية ، قم بقطع الأنسجة الدهنية إلى قطع صغيرة باستخدام الملقط والمشرط. نقل الأنسجة الدهنية إلى أنبوب الطرد المركزي الذي يحتوي على 10 ملليلتر PBS معقم. ابدأ الغسيل عن طريق إمالة أنبوب فالكون لمدة 45 ثانية.
ثم حافظ على الأنبوب واقفا لمدة خمس دقائق لفصله إلى طبقتين. قم بإزالة PBS المتخلل باستخدام حقنة 10 ملليلتر. كرر خطوات الغسيل هذه من أربع إلى خمس مرات حتى يصبح PBS واضحا.
بعد الغسيل ، أعد تعليق الأنسجة الدهنية في محلول الكولاجين ، ثم احتضنها في حمام مائي مهتز حتى يصبح النسيج متجانسا تقريبا. بعد ذلك ، دوامة خليط الكولاجين الأنسجة لمدة 15 ثانية ، ثم جهاز الطرد المركزي بعد ذلك لمدة خمس دقائق. بعد الطرد المركزي ، سيكون لديك ثلاث طبقات.
تخلص بعناية من السوبرناتانت فوق الجزء الوعائي اللحمى. تخلص أولا من طبقة الزيت في الأعلى بعناية ، تليها طبقة الأصداء دون إزعاج حبيبات الكسر الوعائي اللدود. أعد تعليق الجزء الوعائي Stromal في BSA المعقم وأعد جهاز الطرد المركزي لمدة خمس دقائق.
الطرد المركزي كله ، ضع وسائط DMEM F-12 كاملة في قارورة مربعة 25 سم. بعد الطرد المركزي ، تخلص من السوبرناثان وأعد تعليق الكريات الوعائية اللحمية في وسائط DMEM F-12 الكاملة. ونقلها إلى قارورة الثقافة.
مكان في 37 درجة 5٪ حاضنة ثاني أكسيد الكربون. في اليوم التالي ، قم بإزالة الخلايا غير المرفقة واستبدل الوسائط بوسائط جديدة. بدءا من اليوم التالي من العزلة ، ستبدأ الخلايا الشبيهة بالخلايا الليفية في الظهور.
ثم تدريجيا مع مرور الوقت سوف تزداد في العدد والحجم. عن طريق المرور ، ستصبح الخلايا أكثر تجانسا. تظهر هذه الخلايا جميع معايير توصيف الخلايا الجذعية الوسيطة.
تم تمييز هذه الخلايا نحو الخلايا المنتجة للأنسولين باستخدام هذا البروتوكول البسيط الذي يحتوي على نيكوتيناميد بيتا ميركابتوإيثانول وإكسيندين-4. خلال خطوات التمايز ، تبدأ الخلايا في فقدان شكلها الليفي وأعتقد أنها تتجمع مثل المورفولوجيا. عند استخدام الخلايا المنتجة للأنسولين تظهر تلطيخا إيجابيا للديسيثون الأحمر القرمزي ، فإن الخلايا المنتجة للأنسولين المستخدمة تعبر عن علامات خلايا بيتا المختلفة مثل Pdx-1 و mafA والأنسولين.
بالإضافة إلى ذلك ، تفرز الخلايا المنتجة للأنسولين المستحثة مستويات أعلى من الأنسولين في supernatant عند تحديها بتركيز أعلى من الجلوكوز. قدمنا بروتوكولا مفصلا وتدريجيا لعزل وتوصيف الخلايا الجذعية الوسيطة الدهنية. كما نقدم هنا بروتوكولا قصيرا وبسيطا وفعالا نسبيا لتمايز الخلايا الجذعية الوسيطة الدهنية إلى خلايا منتجة للأنسولين.
وهذا يوفر بوابة للباحث لدخول مجال الخلايا الجذعية الوسيطة ودراسة تمايزها إلى خلايا منتجة للأنسولين.
اعرض النص الكامل واحصل على الوصول إلى آلاف الفيديوهات العلمية
نظرة عامة
يصف هذا البروتوكول عملية عزل وتوصيف الخلايا الجذعية الميزنشيمية المشتقة من الأنسجة الدهنية (Ad-MSCs) من نسيج البربخ في الجرذان، متبوعة بتميزها إلى خلايا منتجة للإنسولين (IPCs). إن الطرق المقدمة مباشرة ومصممة لسهولة التطبيق في المختبر.
المكونات الرئيسية للدراسة
مجال العلوم
- بيولوجيا الخلايا الجذعية
- الطب التجديدي
- علم الغدد الصماء
خلفية علمية
- يمكن اشتقاق الخلايا الجذعية الميزنكيمية (MSCs) من أنسجة متنوعة، بما في ذلك النسيج الدهني.
- يعد النسيج الدهني مصدراً غنياً بالخلايا الجذعية الميزنكيمية (MSCs) ذات خصائص زراعية مواتية.
- تمتلك الخلايا الجذعية الميزنكيمية (MSCs) القدرة على التمايز إلى أنواع مختلفة من الخلايا، بما في ذلك الخلايا المنتجة للإنسولين.
- يمكن أن يساعد فهم عملية التمايز في تطوير علاجات لمرض السكري.
الغرض من الدراسة
- عزل وتوصيف الخلايا الجذعية الميزنكيمية المشتقة من البربخ في الجرذ (Ad-MSCs).
- تطوير بروتوكول لتمايز هذه الخلايا إلى خلايا سلفية لإنتاج البدايسرات (IPCs).
- توفير طريقة موثوقة للأبحاث المستقبلية في الطب التجديدي.
الطرق المستخدمة
- عزل الخلايا الجذعية الميزنكيمية (MSCs) المشتقة من الأنسجة الدهنية من دهون البربخ لدى الجرذان.
- توصيف الخلايا الجذعية الميزنكيمية المعزولة باستخدام الواسمات القياسية.
- تحفيز التمايز إلى خلايا منتجة للإنسولين.
- تقييم وظائف الخلايا المنتجة للإنسولين (IPC) بعد التمايز.
النتائج الرئيسية
- عزل ناجح للخلايا الجذعية الميزنكيمية المشتقة من النسيج الدهني (Ad-MSCs) مع علامات سطحية مميزة.
- إثبات تمايز الخلايا الجذعية الميزنكيمية المشتقة من النسيج الدهني (Ad-MSCs) إلى خلايا شبيهة بخلايا بيتا البنكرياسية (IPCs).
- أظهر التقييم الوظيفي قدرة الخلايا الشبيهة بخلايا بيتا البنكرياسية (IPCs) على إفراز الإنسولين.
- يوفر البروتوكول طريقة قابلة للتكرار لتوليد الخلايا الشبيهة بخلايا بيتا البنكرياسية (IPCs) من الخلايا الجذعية الميزنكيمية المشتقة من النسيج الدهني (Ad-MSCs).
الاستنتاجات
- تُعد الخلايا الجذعية الميزنكيمية المشتقة من النخاع الشحمي (Ad-MSCs) مصدراً فعالاً لتوليد خلايا منتجة للأنسولين.
- يمكن لهذا البروتوكول أن يسهل إجراء المزيد من الأبحاث حول علاج مرض السكري.
- قد تستكشف الدراسات المستقبلية الإمكانات العلاجية لهذه الخلايا المنتجة للأنسولين (IPCs).
الأسئلة الشائعة
الأهمية التنفيذية في القطاع الصناعي
توفر الخلايا الجذعية الميزنكيمية المشتقة من الأنسجة الدهنية (Ad-MSCs) مصدراً متجدداً وغير مثير للجدل أخلاقياً لتوليد خلايا منتجة للأنسولين (IPCs) في أبحاث السكري. يوفر هذا البروتوكول طريقة بسيطة وقابلة للتكرار لعزل وتوصيف Ad-MSCs من الدهون البربخية للجرذان، يتبعها تمايز إلى IPCs باستخدام إشارات كيميائية حيوية محددة. ويدعم هذا النهج التحقق من الأهداف وتقليل المخاطر الميكانيكية في المراحل المبكرة من اكتشاف العلاجات للأمراض الأيضية.
التطبيقات الاستراتيجية في البحث والتطوير في مجال الأدوية البيولوجية
الاكتشاف المبكر والتحقق من الهدف
- القيمة العلمية: يتيح استقصاء تعدد القدرات للخلايا الجذعية الميزنكيمية (MSC) والتزام السلالة نحو مصير خلايا بيتا البنكرياسية.
- القيمة التشغيلية: يوفر مصدراً معيارياً للخلايا الجذعية الميزنكيمية المشتقة من الأنسجة الدهنية (Ad-MSCs) مع تعبير مؤكد عن CD90 وCD73 وCD105 لضمان تكرار التجارب.
- القيمة العلمية: يدعم التحقق الوظيفي من الخلايا السلفية البنكرياسية (IPCs) عبر إفراز الإنسولين المحفز بالجلوكوز (GSIS) وتصبيغ الديثيزون، مما يؤكد وجود وظيفة مشابهة لخلايا بيتا.
الفحص وتطوير المقايسة
- القيمة العلمية: توليد خلايا بنكرياسية مشتقة من الخلايا الجذعية المحفزة (IPCs) التي تعبر عن عوامل نسخ رئيسية لخلايا بيتا (Pdx-1, MafA, NKX6.1, Ins1) لاستخدامها في اختبارات فحص المركبات.
- القيمة التشغيلية: تمكين الإنتاج القابل للتوسع لخلايا IPCs من الخلايا الجذعية الميزنشمية المشتقة من النسيج الدهني (Ad-MSCs) للتقييم عالي الإنتاجية لديناميكيات إفراز الإنسولين.
- القيمة العلمية: تسهيل توحيد المقاييس من خلال بروتوكولات تمايز متسقة باستخدام HG-DMEM و β-mercaptoethanol و nicotinamide و exendin-4.
الأبحاث الترجمية وما قبل السريرية
- القيمة العلمية: يوضح الصلة الترجمية من خلال إنتاج خلايا بنكرياسية محفزة (IPCs) تستجيب لتحديات الجلوكوز بزيادة إفراز الإنسولين.
- القيمة التشغيلية: يدعم الاستمرارية قبل السريرية من خلال توفير مصدر خلوي متجدد لاختبار الاستجابة للجرعة والفعالية في نماذج مرض السكري.
- القيمة العلمية: يقلل من المخاطر البيولوجية من خلال تأكيد تعدد القدرات عبر التمايز العظمي والدهني والغضروفي قبل تحفيز الخلايا البنكرياسية المحفزة (IPC).
تكامل مسارات العمل وسير العمل
تندمج هذه الطريقة في تسلسل عمليات الاكتشاف، بدءاً من التحقق المبكر من الهدف وصولاً إلى تحديد المركبات الرائدة ثم التقييم قبل السريري، لا سيما فيما يتعلق بعلاجات السكري التي تستهدف استبدال خلايا بيتا أو تحسين وظائفها.
- بيولوجيا الاكتشاف: تدعم اختبار الفرضيات حول لدونة الخلايا الجذعية الميزنكيمية (MSC) وتحديد السلالة باستخدام إشارات تمايز محددة.
- الفحص المسحي: تتيح إنتاج خلايا شبيهة بخلايا بيتا البنكرياسية (IPC) جاهزة للمقايسة مع مخرجات قابلة للقياس الكمي مثل مستويات إفراز الإنسولين والتعبير عن العلامات الحيوية.
- التحليلات: توفر نقاط نهاية قابلة للقياس بما في ذلك إفراز الإنسولين المحفز بالجلوكوز (GSIS)، وصبغة الديثيزون، وqPCR للعلامات الحيوية للخلايا بيتا لمقارنة الظروف التجريبية.
- الأبحاث الترجمية: تربط بين توليد خلايا IPC في المختبر والتحقق قبل السريري من خلال مقايسات إطلاق الإنسولين الوظيفية.
- إعادة الاستخدام المؤسسي: تؤسس منصة قابلة لإعادة الاستخدام لتوليد خلايا IPC من مصادر دهنية عبر مشاريع وخطوط خلوية متعددة.
التأثير التشغيلي والمؤسسي
- القيمة العلمية: تعزيز الثقة التنبؤية في توليد IPC من خلال التوصيف متعدد السلالات والتحقق الوظيفي.
- القيمة التشغيلية: توحيد معايير استخلاص Ad-MSC وتمايزها وقابلية تكرار ذلك عبر المختبرات المختلفة.
- القيمة الاستراتيجية: توجيه قرارات المضي قدماً أو التوقف في التطوير المبكر لعلاجات السكري من خلال التحقق من النماذج الخلوية لوظيفة خلايا beta.
- تأثير المحفظة: تمكين تحديد الأولويات المعدلة وفقاً للمخاطر للنهج القائمة على الخلايا الجذعية في تدخلات الأمراض الأيضية.
اعتبارات التنفيذ
- تتطلب خبرة في زراعة الخلايا الجذعية، وتقنيات التمايز، وقياس التدفق الخلوي للتنميط المناعي.
- تستلزم الوصول إلى أجهزة الطرد المركزي، وكبائن السلامة البيولوجية، والحاضنات، ومعدات مقايسة إفراز الإنسولين المحفز بالجلوكوز.
- تتطلب توحيد إجراءات الهضم والغسيل والزراعة لضمان الحصول على عائد ثابت من الجزء الوعائي السدوي.
- تتطلب ملاءمة توقيت التمايز وتركيزات الكواشف عند التطبيق على مستودعات دهنية أو أنواع مختلفة.
- تتقيد بالحاجة إلى خلايا من الممر 3-5 لضمان التجانس وتعدد القدرات قبل تحفيز التمايز.
