تقنية معدلة لاستخدام قلوب الفئران حديثي الولادة في إعداد Langendorff

هذا النهج يؤسس بشكل موثوق التروية الرجعية لقلب الفأر خارج الجسم الحي الوليدي في أقل من ثلاث دقائق. وبالتالي تقليل أصغر سن ممكن للدراسة من عدة أسابيع إلى 10 أيام بعد الولادة. يسمح هذا النموذج المعزول الرجعي بدراسة قلب حديثي الولادة خلال فترة حرجة من تطور القلب في أنواع قابلة للتعديل وراثيا ومنخفضة التكلفة.

في حين أن هذا النموذج يفسح المجال لدراسة الاستجابات الفسيولوجية والدوائية لنقص تروية الدم في قلب حديثي الولادة. ويمكن أيضا أن تستخدم لعزل الخلايا العضلية القلبية. لتصنيع قنية الأبهر للفأر حديث الولادة ، استخدم مقص حاد لقطع الطرف وتخفيف نهاية إبرة الفولاذ المقاوم للصدأ قياس 26 ، مع الحرص على عدم تجعيد أو تقييد قطر تجويف الإبرة.

ثم قم بتنعيم الحافة المقطوعة لإزالة أي نتوءات عن طريق كشط الطرف المخفف بلطف على سطح مقعد المختبر باستخدام حركة ذهابا وإيابا. بعد ذلك ، قم بإرفاق القنية المصنعة بجهاز Langendorff وتقييم التدفق والمقاومة. قم بقياس معدلات التدفق عبر القنية عن طريق جمع وقياس كمية المخزن المؤقت على مدى فترة دقيقة واحدة.

لقياس فرق الضغط عبر القنية أثناء تدفق المخزن المؤقت Krebs-Heneseleit ، قم بقياس الضغط في النظام مع وبدون القنية المرفقة. ثم احسب مقاومة القنية باستخدام الصيغة التالية. بعد ذلك ، قم بإزالة قنية قياس 26 من جهاز Langendorff وإرفاق أنبوب عالي الضغط بموقع القنية على الجهاز.

ثم قم بتوصيل القنية الأبهرية بالطرف البعيد من الأنابيب وقم ببث الأنابيب والقنية مع مخزن مؤقت مؤكسج ، مما يضمن إزالة جميع الفقاعات. لمنع تكوين microthrombi التاجي ، قم بإعطاء حقن داخل الصفاق من الهيبارين إلى جرو فأر عمره 10 أيام باستخدام إبرة قياس 26 على حقنة ملليلتر واحدة. اترك عدة دقائق حتى يدور الهيبارين قبل الشروع في حقن أي مخدر.

بعد ذلك ، ضع الفأر المخدر في وضع ضعيف وقم بتأمين الأطراف فور فقدان الوعي. ابدأ الحصاد بمجرد أن لا يستجيب الحيوان لقرصة إصبع القدم حيث يتنفس الحيوان تلقائيا أثناء التشريح الأولي. باستخدام مقص تشريح مستقيم جعل شق subxiphoid عرضية عبر عرض الحيوانات مما يعرض تجويف البطن.

اطلب من أحد المساعدين فهم عملية الخناق باستخدام ملقط ، ثم قطع القفص الصدري ثنائيا على طول خط الإبط الأوسط في اتجاه الرأس وعكس القص والأضلاع قحفيا لفضح الأعضاء الصدرية. بعد تحديد الحجاب الحاجز بشكل متفوق ، قم بشق الجزء الأمامي تماما. تحديد الوريد الأجوف السفلي تحت الإشعاع فوق الكبد ونقله بمقص قزحية منحني مع الحفاظ على توتر طفيف في الرأس على الجزء القريب باستخدام ملقط القزحية.

ثم، قم بقص الجزء الخلفي على طول السطح الداخلي للعمود الفقري باستخدام مقص القزحية المنحني أثناء سحب الوريد الأجوف السفلي لأعلى وخارج التجويف الصدري. أثناء تعبئة القلب ، قم بزاوية المقص أماميا واقطع الأوعية الكبيرة بشكل متفوق لإزالة القلب والرئتين تماما. على الفور غمر العينة في الجليد البارد Krebs-Henseleit العازلة أو المالحة.

يجب أن يتوقف القلب عن النبض في غضون ثوان. ضع قطعة من المنشفة الورقية في الجزء السفلي من طبق بتري ضحل لتوفير الاحتكاك لتحقيق الاستقرار في القلب أثناء التعليب. بلل المنشفة الورقية بعازل كريبس-هنسليت البارد لمنع القلب من الالتصاق به.

ضع طبق بتري المحضر تحت المجهر التشريحي واضبط التركيز. الآن ، ضع قنية الأبهر المتصلة بأنبوب تمديد الضغط العالي تحت المجهر التشريحي ، إلى جانب خياطة حريرية 5-0 مربوطة بشكل فضفاض حول محورها. بعد وضع الأعضاء الصدرية المستأصلة في طبق بتري ، حدد الغدة الصعترية بلمعانها الأبيض وفصوصها ووجه العينة بحيث تكون الغدة الصعترية أمامية ومتفوقة.

بعد ذلك ، باستخدام ملقط يفصل بصراحة فصوص الغدة الصعترية التي تعرض الأوعية الكبيرة. ثم حدد الشريان الأورطي عن طريق تحديد السمات المتفرعة المميزة لقوس الأبهر ونقله بالقرب من الشريان تحت الترقوة باستخدام مقص حاد دقيق. الآن أمسك بلطف الشريان الأورطي العابر باستخدام ملقط منحني ناعم على غرار الصائغ وقم بتقليب الشريان الأورطي بعناية باستخدام إبرة حادة قياس 26 ، مع الحرص على عدم إتلاف الصمام الأبهري.

باستخدام ملقط منحني ناعم ، أمسك الشريان الأورطي حول القنية وابدأ التروية الرجعية للحد من وقت نقص التروية. اطلب من المساعد أن يمسك بأطراف الخيط المربوط بشكل فضفاض وأن يحاصر بعناية الشريان الأورطي حول الكانيولا. قم بربط الخيط فوق أو أسفل الملقط المنحني الناعم ثم شد الخيط وتأكد من كفاية تدفق الشريان التاجي.

افصل أنبوب الضغط العالي عن جهاز Langendorff ، وأمسك بمحور القنية وافصل الإبرة الحادة عن أنابيب تمديد الضغط العالي. ثم نعلق بسرعة محور قنية إلى الجهاز. بمجرد تعليق القلب على جهاز Langendorff في الموضع المعتاد ، يتم تأكيد التروية الكافية.

تقليم بعناية الرئة والغدة الصعترية والأنسجة الزائدة. ثم قم بشق الأذين الأيمن للسماح للسائل الجيبي التاجي بالتنقيط بحرية. اصنع عقدة صغيرة في نهاية خياطة حريرية 5-0 ، ثم اخترق قطعة صغيرة من فيلم البارافين بالإبرة وحرك البارافين إلى النهاية المعقودة.

مرر الإبرة بعناية عبر قمة البطين واسحب الخيط عبر القلب حتى يصبح فيلم البارافين دافئا ضد الجدار الجانبي للبطين. مرر الإبرة من خلال فتحة سترة الاحترار المملوءة بالماء لجهاز Langendorff بحيث يمكن تغليف القلب وتسخينه. ثم قم بتوصيل الإبرة بمحول الطاقة لتجنب تنقيط الجيوب الأنفية التاجية.

اضبط الخيط لتطبيق غرام إلى جرامين من التوتر القاعدي كما هو موضح في التوتر الانبساطي أو تتبع نية الحضيض. ثم ضع أقطاب كهربائية سطحية على القطبين العلوي والسفلي للقلب لتسجيل مخطط كهربية القلب. وأخيرا، قم بأخذ عينة من النفايات السائلة للجيوب الأنفية التاجية لتحليلها باستخدام قسطرة وريدية قياس 24.

تم استخدام الأقطاب الكهربائية السطحية لتسجيل مخطط كهربية القلب المستمر ، مما سمح بتحديد المعدل والإيقاع الداخليين. جميع القلوب المنصهرة بشكل كاف تنبض تلقائيا في إيقاع الجيوب الأنفية. تلبي استراتيجية التروية هذه الاحتياجات الأيضية لقلب الفأر حديث الولادة ، نظرا لإنتاج اللاكتات الضئيل وانخفاض نسبة استخراج الأكسجين واستهلاك الجلوكوز.

كما تم تسجيل وحساب وسائل متغيرة فسيولوجية ، مثل متوسط معدل ضربات القلب الجوهري الجوهري ومتوسط ضغوط التروية الأبهرية المرصودة. يجب النظر في بعض المعايير الاستبعادية مثل الوقت اللازم لبدء إعادة التروية ومدة عدم انتظام ضربات القلب وضغط التروية الأبهري لضمان اتساق إعداد حديثي الولادة. بعد إنشاء التروية ، قد يحدث تدخل مثل توصيل الدواء ، أو تحريض إصابة نقص التروية ، أو تغييرات في المستقلبات أو توصيل العوامل الأنزيمية لعزل الخلايا العضلية القلبية.