مقارنة طرق عزل الفطريات المسببة للأمراض الحشرية من عينات التربة
يناير 6, 2022
يتم عزل المستعمرات الفطرية المسببة للأمراض الحشرية من عينات التربة الاستوائية باستخدام طعم تينيبريو ، طعم غاليريا ، وكذلك الوسط الاصطناعي الانتقائي ، أي أجار سكر العنب البطاطس المخصب بمستخلص الخميرة المكمل بالكلورامفينيكول ، الثيابيندازول ، وسيكلوهيكسيميد (وسط CTC).
تعد عزلة الفطريات المسببة للأمراض الحشرية مهمة لتطوير مبيد حيوي ويمكن أن تكون مفيدة لدراسة التنوع والتوزيع والبيئة لهذه المجموعة بالذات. يعتبر استخدام طعوم الحشرات لعزل الفطريات المسببة للأمراض الحشرية طريقة منخفضة التكلفة وعالية الكفاءة. الكلورامفينيكول ، الثيابيندازول ، السيكلوهيكسيميد ، الوسائط الاصطناعية لا تستخدم دودين وتتطلب مساحة أقل في عملية عينة التربة.
وتشمل الخطوات الحاسمة التحقيق في صفائح CTC بعد أسبوع وأسبوعين لمنع الفطريات الأخرى من التضييق والفطريات المسببة للأمراض الحشرية في التطور ، ثم تحديد مستعمرات الفطريات المسببة للأمراض الحشرية بناء على مورفولوجيتها الكلية ومورفولوجيا الجزئية. ابدأ بجمع 800 جرام من التربة على عمق 10 سم باستخدام مجرفة صغيرة. تخزين العينات في أكياس البولي بروبلين في درجة حرارة الغرفة حتى بداية التجربة.
يمكن أيضا جمع الجذور الصغيرة لأن الفطريات المسببة للأمراض الحشرية معروفة بكفاءة الريزوسفير. لعزل الفطريات باستخدام الكلورامفينيكول أو الثيابيندازول أو السيكلوهيكسيميد أو الوسط الاصطناعي الانتقائي CTC ، يزن 0.35 جرام من عينة التربة مع أو بدون جذور. ضع هذه العينة في أنبوب دقيق 1.5 ملليلتر.
أثناء العمل في خزانة السلامة الأحيائية، أضف ملليلتر واحد من التعليق المائي المعقم بنسبة 0.01 في المائة من البولي أوكسي إيثيلين سوربيتان أحادي الكوليت إلى الأنبوب الصغير الذي يحتوي على تربة ودوامة الأنبوب لمدة 30 ثانية. عند الانتهاء من إزالة وماصة 50 ميكرولتر من supernatant على وسط لوحات بتري مع وسط CTC. ثم استخدم ملعقة Drigalski معقمة قطرها ستة ملليمترات لتفريق المعلقات بشكل متجانس على سطح الوسط.
احتضان الألواح في غرف المناخ عند 25 درجة مئوية ورطوبة نسبية لا تقل عن 80٪ في الظلام. بعد سبعة و 14 و 21 يوما من الحضانة ، راقب اللوحات لنمو المستعمرات الفطرية. لعزل الفطريات باستخدام سطح مطهر غاليريا ميلونيلا ويرقات تينبريو موليتور في مرحلة متأخرة كطعوم حشرات.
اغمر اليرقة في هيبوكلوريت الصوديوم بنسبة 0.5٪ لمدة دقيقة واحدة للتعقيم. ثم اغسل اليرقات مرتين بالماء المعقم. قم بتجميع الطعوم في أواني بلاستيكية بها 10 ثقوب صغيرة قطرها 10 ملليمترات في الغطاء تحتوي على 250 جراما من التربة المجمعة.
تجانس التربة كل يومين للسماح بأقصى قدر من الاتصال بين اليرقات وتحليل الأواني يوميا ، بحثا عن الحشرات الميتة. بعد إزالة الحشرات الميتة من الوعاء ، قم بتعقيم الحشرات بشكل سطحي بنسبة 0.5٪ من هيبوكلوريت الصوديوم لمدة دقيقة واحدة. لصالح الفطار ، ضع الحشرات المعقمة في غرفة رطبة عند رطوبة نسبية 80٪ و 25 درجة مئوية لمدة سبعة أيام.
على الفطار ، قم بحصاد الكونيديا من سطح الحشرات وبمساعدة الحلقة الميكروبيولوجية ، ضع الكونيديا على وسط أجار سكر العنب بالبطاطس الذي يحتوي على 0.05٪ كلورامفينيكول أو وسط PDAC تحت مجهر مجسم. كبديل ، ضع اليرقات المصابة بأكملها على وسط PDAC. واحتضان لوحات الثقافة في غرفة المناخ كما هو موضح سابقا.
بعد 14 يوما من الحضانة ، حدد أنواع EPF من خلال تحليل الخصائص المورفولوجية الكلية للثقافات الفطرية على الألواح كما هو موضح في المخطوطة. بعد ذلك ، انقل الكونيديا الهوائية إلى مزارع الانزلاق لمدة ثلاثة أيام عند رطوبة نسبية 80٪ و 25 درجة مئوية. بعد ثلاثة أيام تلطيخ الشريحة باللون الأزرق لاكتوفينول لمراقبة الميزات المجهرية.
تحت المجهر الضوئي ، راقب الهياكل الفطرية مثل الترتيب ، conidiophores ، شكل وحجم conidia في 400 مرة وتأكيد تحديد EPF. في الدراسة ، تم عزل 51 سلالة EPF من أنواع Metarhizium و Beaveria من 524 عينة تربة. يظهر التحليل التمثيلي الخصائص الميكرومورفولوجية لعدد قليل من العزلات من أنواع Metarhizium وأنواع Beaveria.
تمت دراسة حدوث EPF في عينات التربة ال 24 باستخدام ثلاث طرق مختلفة للعزل. أثبت طعم غاليريا ميلونيلا أنه أكثر كفاءة في العزلة ، يليه طعم تينيبريو موليتور ووسط CTC. ولم تظهر نفس عينات التربة البالغ عددها 24 عينة أي تعافي لأنواع بيفيريا، بل أظهرت فقط الميتاريزيوم.
أهم الأشياء التي يجب تذكرها هي نقل الكونيديا الهوائية إلى معطف منزلق يراقب ميزات المجهر ويؤكد تحديد الفطريات المسببة للأمراض الحشرية باستخدام مفاتيح مورفولوجية. وتشمل الطرق الإضافية استخدام وسائط اصطناعية انتقائية أخرى مع مواد كيميائية محددة للحد من نمو الملوثات مثل دودين. إن البحث عن عزلات فطرية جديدة ذات سمات مكافحة حيوية بارزة أمر بالغ الأهمية لزيادة فعالية الفطريات في مكافحة آفات المفصليات واستكشاف المزيد من الأسئلة في مجال علم أمراض اللافقاريات.
اعرض النص الكامل واحصل على الوصول إلى آلاف الفيديوهات العلمية
نظرة عامة
تبحث هذه الدراسة في عزل الفطريات الممرضة للحشرات من التربة الاستوائية باستخدام طعوم حشرية، مع تسليط الضوء على كفاءة الطرق المختلفة. يهدف هذا العزل إلى تعزيز فهم التنوع الفطري والمساهمة في تطوير المبيدات الحيوية.
المكونات الرئيسية للدراسة
مجال البحث
- الفطريات الممرضة للحشرات
- ميكروبيولوجيا التربة
- تطوير المبيدات الحيوية
خلفية علمية
- طرق منخفضة التكلفة لعزل الفطريات الممرضة للحشرات.
- أهمية تقييم عينات التربة للدراسات البيئية.
- استخدام الأوساط الانتقائية للعزل الفطري الفعال.
الطرق المستخدمة
- عزل الفطريات باستخدام طعوم حشرية (Galleria mellonella و Tenebrio molitor).
- استخدام أوساط اصطناعية اختيارية (وسط CTC، وأجار بطاطس ديكستروز).
- الفحص المجهري لتحديد أنواع الفطريات.
النتائج الرئيسية
- 51 سلالة من أنواع Metarhizium وBeauveria تم عزلها من 524 عينة تربة.
- أظهر الطعم Galleria mellonella أعلى كفاءة في عزل الفطريات.
- لم يتم استعادة أي أنواع من Beauveria من العينات المختبرة.
الاستنتاجات
- توضح الدراسة بشكل فعال طرق عزل الفطريات الممرضة للحشرات.
- تساهم النتائج في أبحاث المكافحة الحيوية والتطبيقات الزراعية المحتملة.
الأسئلة الشائعة
الأهمية الصناعية التنفيذية
يُعد عزل الفطريات الممرضة للحشرات من التربة خطوة أساسية في اكتشاف المبيدات الحيوية، حيث تؤثر كفاءة الطريقة بشكل مباشر على التحقق من الهدف وتحديد المركبات الرائدة. وتتيح مقارنة استخدام الطعوم الحشرية مقابل الأوساط الانتقائية الحد من المخاطر في مرحلة الفرز الأولية للمرشحات المضادة للفطريات، وذلك من خلال تحسين عائد العزل وتقليل السلبيات الكاذبة. وهذا يعزز الثقة التنبؤية في اختيار الأهداف لبرامج مكافحة الآفات المفصلية.
التطبيقات الاستراتيجية في البحث والتطوير في مجال الأدوية الحيوية
الاكتشاف المبكر والتحقق من الهدف
- القيمة العلمية: تتيح استقصاء التنوع البيولوجي الفطري في الأنظمة البيئية للتربة لتحديد سلالات جديدة من *Metarhizium* و*Beauveria* ذات نشاط بيولوجي محتمل.
- القيمة التشغيلية: توفر طرق استدراج الحشرات (*Galleria mellonella*، *Tenebrio molitor*) كفاءة عزل أعلى من وسط CTC، مما يزيد من إمكانية الوصول إلى الكائنات المستهدفة للتوصيف اللاحق.
- القيمة التطبيقية: تدعم السلالات المعزولة عملية تقليل المخاطر الآلية من خلال ربط الضراوة المظهرية بالهوية الجينية عن طريق التحديد المورفولوجي والجزيئي.
الفحص وتطوير المقايسة
- القيمة العلمية: يوفر عزلات فطرية موثقة لتطوير المقاييس التي تستهدف القدرة الإمراضية لمفصليات الأرجل وخصوصية نطاق المضيف.
- القيمة التشغيلية: تساهم بروتوكولات العزل الموحدة باستخدام الطعوم الحشرية في تحسين إمكانية تكرار النتائج وقابلية التوسع في استعادة الفطريات من دفعات عينات التربة.
- جاهزية المقاييس: يتيح تحضير مستنبتات نقية لحصاد الأبواغ الكونيدية والتأكيد المورفولوجي عبر الشرائح، مما يدعم مدخلات الفحص المظهري المتسقة.
الأبحاث الانتقالية وما قبل السريرية
- النظام ذو الصلة بالمرض: تُستخدم سلالات EPF المعزولة كنماذج ما قبل سريرية لتقييم الفوعة ضد الآفات الحشرية، بما يتماشى مع تطوير منتجات المكافحة الحيوية.
- الثقة التنبؤية: يعزز التحديد الجزيئي للعزلات على مستوى النوع من الثقة في الهدف ويدعم اختيار السلالات لدراسات الصياغة.
- الاستمرارية: تتيح سير عمل العزل المعتمدة تتبعاً طولياً لوجود الفطريات في الترب الزراعية، مما يوجه استراتيجيات إدارة المقاومة وتدوير السلالات.
تكامل مسار العمل وسير العمل
تندرج طريقة العزل هذه ضمن سير عمل الاكتشاف المبكر، حيث تخضع سلالات EPF المستردة للفحص المظهري لتحديد الفوعة والخصوصية تجاه العائل، مما يساهم في تحديد المرشحات الواعدة في مسارات تطوير المبيدات الحيوية.
- بيولوجيا الاكتشاف: تدعم اختبار الفرضيات حول إيكولوجيا الفطريات وإمراضيتها من خلال تمكين استعادة الفطريات مجهرية التربة (EPF) من مصفوفات التربة المعقدة.
- المسح: تولد تحضيرات فطرية قياسية لاختبارات الفوعة عالية الإنتاجية باستخدام عوائل حشرية.
- التحليلات: توفر مخرجات التحديد المورفولوجي والجزيئي بيانات كمية ونوعية لمقارنة السلالات واختيارها.
- الأبحاث الانتقالية: تربط بين العزل البيئي والتقييم قبل السريري من خلال آليات الفوعة المحفوظة في *Metarhizium* و *Beauveria*.
- إعادة الاستخدام المؤسسي: يمكن توحيد بروتوكول العزل باستخدام الطعوم الحشرية عبر المواقع وأنواع التربة المختلفة، مما يتيح إنشاء بنوك سلالات فطرية قابلة للتوسع لحملات المسح المستقبلية.
التأثير التشغيلي والمؤسسي
- القيمة العلمية: تزيد من تنوع الأهداف وتقلل من الغموض الميكانيكي في اختيار أهداف EPF لتطوير المبيدات الحيوية.
- القيمة التشغيلية: توفر طرق طعوم الحشرات إنتاجية أعلى وتقللاً في التباين التقني مقارنة بالبيئات الانتقائية، مما يحسن معدلات نجاح العزل.
- القيمة الاستراتيجية: تتيح اتخاذ قرارات "المضي قدماً أو التوقف" بشكل أفضل في تحديد أولويات السلالات من خلال زيادة الوصول إلى العزلات شديدة الضراوة من العينات البيئية.
- تأثير المحفظة: تدعم التقدم المعدل حسب المخاطر من خلال توسيع مجموعة سلالات EPF الموصوفة ذات المورفولوجيا والهوية المؤكدة.
اعتبارات التنفيذ
- يتطلب خبرة في التعامل مع الحشرات، ومورفولوجيا الفطريات، والتقنيات العقمية لتحضير الطعوم وحصاد الأبواغ (conidia).
- يتطلب غرف تحضين يتم التحكم في مناخها للحفاظ على درجة حرارة 25°C ورطوبة 80% من أجل النمو الفطري وتحفيز داء الفطريات (mycosis).
- تتطلب عملية التوحيد بين الفرق تعقيماً متسقاً للطعوم، وتجانس التربة، وجداول زمنية محددة لمعالجة ما بعد داء الفطريات.
- قد يتطلب التكيف مع أنواع التربة المختلفة تعديلات في وقت تعريض الطعوم وحجم التربة بناءً على انتشار الفطريات الممرضة للحشرات (EPF) المحلية.
- تشمل القيود الاعتماد على حيوية اليرقات والظروف البيئية التي تؤثر على نجاح داء الفطريات، كما هو موضح في اعتماد البروتوكول على الغرف الرطبة وخطوات التعقيم السطحي.
الأسئلة الشائعة حول الأدوية الحيوية
Chapters in this video
0:04
Introduction
1:07
Soil Sampling and Isolation Methods for Entomopathogenic Fungi (EPF)
4:29
Identification of Entomopathogenic Fungi (EPF): Metarhizium and Beauveria Species
5:21
Results: Micromorphological Characteristics and Occurrence of Entomopathogenic Fungi in Various Soil Samples
6:16
Conclusion
