مراقبة حركية تجميع البروتين في الجسم الحي باستخدام عد التضمين الآلي في Caenorhabditis elegans
ديسمبر 17, 2021
هنا ، يتم تقديم طريقة لتحليل حركية تجميع البروتين في الديدان الخيطية Caenorhabditis elegans. يتم تصوير الحيوانات من مجموعة سكانية متزامنة مع العمر في نقاط زمنية مختلفة ، تليها عد التضمين شبه الآلي في CellProfiler وتناسبها مع نموذج رياضي في AmyloFit.
تم التحقيق في آليات تجميع البروتين حتى الآن في الغالب في المختبر. مع بروتوكولنا يمكننا إجراء دراسات كمية مماثلة في الكائن الحي النموذجي C.elegans. الميزة الرئيسية لطريقتنا هي القياس الكمي غير المتحيز لأرقام التضمين.
ومن خلال ملاءمة هذه البيانات عالية الجودة، مع النماذج الرياضية، يمكننا الحصول على رؤى حول آلية التجميع. يحدث تراكم البروتين في العديد من الأمراض، بما في ذلك مرض الزهايمر وهانتنغتون. يعد فهم الآلية الجزيئية لتجميع البروتين في الجسم الحي أمرا بالغ الأهمية لتطوير علاجات جديدة.
ابدأ بوضع 10 ديدان خيطية بالغة على صفيحة NGM ببذور 6 سم مع اختيار دودة بلاتينية لإجراء وضع بيض متزامن. اترك البالغين يضعون البيض لمدة ساعتين تقريبا عند 20 درجة مئوية قبل إزالته من الطبق. ضع الأطباق مع البيض في الحاضنة في الساعة 20 م.راقب تطور الحيوانات حتى تصل إلى مرحلة البلوغ في اليوم الثالث تقريبا بعد وضع البيض.
قم بإعداد الصفيحة المكونة من 384 بئرا عن طريق ملء العدد المطلوب من الآبار ب 100 لتر من المخزن المؤقت M9 مع استكماله بأزيد الصوديوم 25 mM كمخدر. املأ بئرا واحدا لكل سلالة ليتم تصويرها. لكل سلالة ، انقل 20 حيوانا إلى بئر واحد باستخدام اختيار دودة البلاتين.
قم بتغطية اللوحة بالغطاء للتبخر الوقائي ، وقم بتصوير اللوحة في غضون ساعة واحدة بعد التحضير. قم بتشغيل الأداة ، وافتح البرنامج. انقر على زر التشغيل بجوار تفريغ لوحات الآبار ، ووضع لوحة 384 بئر في المجهر.
ضمن قائمة الإجراءات واكتساب التألق 3D، انقر فوق اختبار، وحدد الديدان التي تحتوي على البئر. اضبط معالجة الصور على لا شيء. وانقر فوق الزر تشغيل لتحديد مسافة التحول المثلى التي تتمركز فيها الديدان بشكل صحيح.
اضبط المسافة التصاعدية على 50 مترا، والمسافة التنازلية على 50 مترا، والفاصل الزمني للتقطيع على 2 متر لالتقاط سمك الحيوانات بالكامل في المكدس z. اضبط معالجة الصور مرة أخرى على الحد الأقصى. حدد الآبار المراد تصويرها ضمن إعداد مسح لوحة البئر.
ثم حدد البلاط والحصول على البئر بالكامل. احفظ إعداد القياس. وانقر فوق بدء القياس لبدء التجربة.
افتح CellProfiler واسحب خط الأنابيب إلى النافذة إسقاط ملف خط أنابيب هنا. انقر فوق نعم لتحميل المشروع. بعد ذلك ، اسحب الصور المخيطة إلى نافذة إسقاط الملفات والمجلد هنا.
انقر على وحدة إدخال البيانات الوصفية. اضبط التعبير العادي للاستخراج من اسم الملف وفقا لأسماء الصور المخيطة. انقر فوق وحدة إدخال NamesAndTypes ، واضبط تحديد معايير القاعدة لمطابقة القنوات في أسماء الملفات.
ثم انقر فوق إعدادات الإخراج لتحديد مجلد لحفظ الإخراج من CellProfiler. انقر فوق بدء وضع الاختبار للتحقق من إعدادات خط الأنابيب باستخدام مجموعة بيانات التصوير الأولى. انقر فوق خطوة لتشغيل عبر خط الأنابيب ، وحدة واحدة في كل مرة.
لضبط الخطوط العريضة للفيروس المتنقل ، انقر فوق إظهار التعليمات في الوحدة النمطية EditObjectsManually لرؤية التعليمات. تصحيح الخطوط العريضة. ثم انقر فوق تم لمتابعة تشغيل خط الأنابيب.
انقر فوق الخروج من وضع الاختبار وتحليل الصور. افتح مجلد الإخراج لعرض ملفات الإخراج. وافتح الصور باسم الملف الأصلي متبوعا بالخطوط العريضة للتحقق مما إذا كانت الديدان والتضمينات قد تم وضعها بشكل صحيح.
لبدء استخدام AmyloFit ، قم بتسمية المشروع وانقر فوق إنشاء مشروع. انقر فوق فتح لفتحه. وإنشاء جلسة عن طريق إعطائها اسما والنقر على إنشاء وتحميل الجلسة.
انقر فوق إضافة بيانات، وقم بتحميل الملف الذي يحتوي على متوسط أعداد التضمينات لكل حيوان، باتباع متطلبات تنسيق البيانات الموضحة في اللوحة اليمنى. ثم انقر فوق تحميل بيانات جديدة. قم بتعيين عدد النقاط إلى المتوسط فوق إزاحة نقطة الصفر إلى 0، وقم بتعيين عدد النقاط إلى المتوسط فوق الهضبة إلى 0 لتخطي خطوات المعالجة المسبقة، والتي ليست مطلوبة لبيانات حساب التضمين.
ثم انقر فوق إرسال. كرر هذه الخطوة لكل تركيز بروتين. حدد مخصص في لوحة النموذج.
أدخل معادلة النوى المستقل في مربع المعادلة. وانقر فوق تحميل النموذج. بالنسبة إلى Ncells، اضبط نوع المعلمة على Global Constant، واضبط القيمة على 95، المقابلة لعدد خلايا عضلات جدار الجسم.
قم بتعيين أنواع المعلمات إلى Global fit ل Kcell و n. وإلى ثابت ل م. أدخل قيم m للسلالات المختلفة في اللوحة اليمنى.
اترك عدد قفزات الحوض دون تغيير، وانقر فوق احتواء في لوحة التركيب. أخيرا ، قم باستخراج الملاءمة بالنقر فوق تنزيل البيانات و Fit. تم رصد أرقام التضمين في أربع سلالات C.elegans تعبر عن تركيزات Q40 مختلفة.
يصف نموذج النوى المستقل حركية التجميع جيدا. أسفر التناسب عن ترتيب تفاعل قدره 2.1 ، ومعدل نواة قدره 0.38 جزيء يوميا لكل خلية عند تركيز بروتين داخل الخلايا يبلغ 1 ملليمتر. أظهر اثنان من النسخ المتماثلة البيولوجية المستقلة في دراسة سابقة قيما متطابقة بشكل وثيق لترتيب التفاعل ومعدل النوى.
شيء واحد يجب أن يؤخذ في الاعتبار هو أنك تحتاج إلى مجموعات بيانات عالية الجودة لتركيزات البروتين المتعددة للحصول على نوبات موثوقة. يمكن استخدام هذه الطريقة لإيجاد طرق للتداخل مع تراكم البروتين في كائن حي ، مثل الضربات القاضية الجينية أو علاجات الجزيئات الصغيرة.
نظرة عامة
تقدم هذه المقالة طريقة لتحليل ديناميكيات تجميع البروتين في الديدان الخيطية Caenorhabditis elegans. يسمح البروتوكول بتحديد عددي دقيق للتراكيب من خلال التصوير والنمذجة الرياضية.
مكونات الدراسة الرئيسية
مجال العلوم
- علم الأعصاب
- علم الأحياء
- تجميع البروتين
الخلفية
- يرتبط تجميع البروتين بالعديد من الأمراض، بما في ذلك ألزهايمر وهنتينغتون.
- ركزت الدراسات السابقة بشكل رئيسي على الأساليب المختبرية.
- فهم الآليات الحية ضروري لتطوير العلاجات.
- تعمل Caenorhabditis elegans ككائن نموذجي لمثل هذه الدراسات.
غرض الدراسة
- تطوير طريقة لدراسة تجميع البروتين في كائن حي.
- لتحديد عددي التراكيب بدقة واستخلاص رؤى حول آليات التجميع.
- تسهيل استكشاف التدخلات العلاجية.
الطرق المستخدمة
- يتم تصوير الديدان الخيطية C. elegans الموحدة عمريًا في نقاط زمنية مختلفة.
- يتم إجراء عد التراكيب باستخدام CellProfiler.
- يتم ملاءمة البيانات للنماذج الرياضية باستخدام AmyloFit.
- تشمل الظروف التجريبية تحضيرات محددة لدرجة الحرارة والمحاليل العازلة.
النتائج الرئيسية
- يصف نموذج النواة المستقلة بشكل فعال ديناميكيات التجميع.
- تم تحديد ترتيب التفاعل 2.1 ومعدل النواة 0.38 جزيء يوميًا لكل خلية.
- تعتبر مجموعات البيانات عالية الجودة ضرورية للحصول على ملاءمات موثوقة.
- يمكن تطبيق الطريقة للتحقيق في التدخلات الوراثية أو الدوائية.
الاستنتاجات
- توفر هذه الطريقة إطارًا قويًا لدراسة تجميع البروتين في الجسم الحي.
- يمكن أن تفيد الرؤى المكتسبة في وضع استراتيجيات علاجية للأمراض ذات الصلة.
- قد تستكشف الدراسات المستقبلية تركيزات بروتينية وظروف إضافية.
الأسئلة الشائعة
Executive Industry Relevance
Quantifying protein aggregation kinetics in vivo addresses a critical gap in neurodegenerative disease research, where in vitro models often fail to capture cellular complexity. This method enables unbiased, time-resolved measurement of inclusion formation in a genetically tractable organism, supporting target validation and mechanistic de-risking. By linking quantitative imaging to mathematical modeling, it provides predictive confidence for evaluating proteostasis modifiers and therapeutic candidates in a disease-relevant system.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by quantifying aggregation kinetics in living muscle cells.
- Operational Value: Supports biological de-risking through unbiased inclusion counting across genetic strains.
- Predictive Value: Fitting data to independent nucleation models clarifies mechanism and informs target confidence.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates quantitative, time-resolved inclusion counts suitable for assay standardization.
- Operational Value: Integrates high-throughput imaging with automated image analysis for reproducible outputs.
- Scalability: Uses 384-well plate format to enable screening of genetic or pharmacological modulators.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Models human protein aggregation diseases like Huntington’s via polyQ expression in C. elegans.
- Mechanistic De-risking: Derives nucleation rate and reaction order to distinguish between aggregation mechanisms.
- Risk-Adjusted Advancement: Quantifies effects of interventions on aggregation kinetics to inform go/no-go decisions.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within early discovery to lead identification, where quantitative aggregation data informs target selection and compound screening.
- Discovery Biology: Tests hypotheses about nucleation-dependent aggregation using time-lapse inclusion data.
- Screening: Produces assay-ready, quantitative readouts for compound or genetic library evaluation.
- Analytics: Employs mathematical fitting to extract kinetic parameters (Kcell, n) that enable condition comparison.
- Translational Research: Uses disease-relevant polyQ model to bridge in vivo findings to human pathology.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable imaging and analysis workflow for chronic proteinopathy studies.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Reduces mechanistic ambiguity by linking inclusion counts to biophysical models of aggregation.
- Operational Value: Standardizes quantification via automated pipelines, minimizing inter-observer variability.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by providing kinetic, not just endpoint, aggregation data.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of targets based on mechanism and modulation potential.
Implementation Considerations
- Requires expertise in confocal microscopy, image analysis (CellProfiler), and kinetic modeling (AmyloFit).
- Dependent on instrumentation capable of 3D fluorescence z-stacking in multi-well formats.
- Necessitates standardization of worm handling, staining, and imaging timing across operators.
- Adaptation to other tissues or models may require adjustments to segmentation and signal thresholds.
- Relies on high-quality, multi-concentration datasets for reliable model fitting, as noted in the transcript.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:04
Introduction
0:42
Growth of an Age-Synchronized Population of C. elegans
1:12
Sample Preparation of C. elegans in a Multiwell Plate
1:43
Image Acquisition on the High-Throughput Confocal Microscope
2:45
Automated Inclusion Counting Using CellProfiler
4:07
Global Fitting of Inclusion Count Data Using AmyloFit
5:39
Results: Fitting the Data to a Mathematical Model in AmyloFit
6:16
Conclusion
