تحديد كمية نقل الحديد عبر مشيمة الفأر في الجسم الحي باستخدام نظائر الحديد غير المشعة

هذا البروتوكول مهم لأنه يمكن الباحثين من تتبع وقياس توزيع الحديد في الجسم الحي دون الحاجة إلى النشاط الإشعاعي. نظرا لأنه يمكن اكتشاف العديد من نظائر الحديد المستقرة بشكل متزامن داخل نفس العينة ، يمكن استخدام هذه التقنية لفهم امتصاص الحديد وتنظيمه وتوزيعه من مصادر مختلفة. للبدء ، أضف 12 حمض الهيدروكلوريك العادي إلى الحديد 58 في القارورة الزجاجية التي يوفرها البائع ، واستبدل الغطاء بشكل غير محكم.

لإذابة الحديد ، قم بتسخين المحلول عند 60 درجة مئوية لمدة ساعة واحدة. إذا لم يذوب بعد ، اترك المحلول طوال الليل في درجة حرارة الغرفة في غطاء الدخان ليذوب. ثم لتوليد محلول كلوريد الحديديك ، قم بأكسدة أي كلوريد حديدي متبقي عن طريق تسخين المحلول إلى 60 درجة مئوية مع إيقاف الغطاء لتسهيل الأكسدة.

أضف ميكرولترا واحدا من 35٪ بيروكسيد الهيدروجين لكل 50 ميكرولتر من المحلول لتسهيل الأكسدة. اترك محلول كلوريد الحديديك في الغطاء عند 60 درجة مئوية مع إيقاف الغطاء لتبخير العينة. ثم أعد تكوين كلوريد الحديديك إلى 100 ملليمول بماء فائق النقاء.

احسب كمية الماء المطلوبة بناء على وزن المعدن الأولي. بعد ذلك ، قم بإعداد ملليلتر واحد من نيتريلوتريأسيتات الحديديك عن طريق احتضان محلول كلوريد الحديديك المحضر مع نيتريلوتريأسيتات بنسبة مولار واحد إلى خمسة في وجود 20 مليمولار بيكربونات الصوديوم لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة. ثم قم بإذابة 500 ملليغرام من أوترانسفيرين في أربعة ملليلتر من محلول النقل والتحميل ، وأضف أربعة ملليلتر من محلول أوترانسفيرين هذا إلى محلول نيتريلوتريأسيتات الحديديك المحضر في أنبوب سعة 15 ملليلتر.

للسماح بالتحميل الأقصى لنيتريلوتريأسيتات الحديديك على أوترانسفيرين ، تحقق من أن المحلول عند الرقم الهيدروجيني 7.5 واضبط الرقم الهيدروجيني إذا لزم الأمر باستخدام بيكربونات الصوديوم أو حمض الهيدروكلوريك. احتضان الخليط لمدة 2 1/2 ساعة في درجة حرارة الغرفة. بعد ذلك ، قم بإزالة نيتريلوتريأسيتات الحديديك غير المنضمة الزائدة وإطلاق نيتريلوتريأسيتات عن طريق نقل محلول ترانسفيرين الحديد -58 إلى عمود قطع الوزن الجزيئي والطرد المركزي للعمود.

بعد الطرد المركزي ، اغسل العمود مرتين بإضافة 10 ملليلتر من مخزن تحميل الترانسفيرين والطرد المركزي للعمود. ثم اغسل العمود ب 10 ملليلتر من المياه المالحة وأجهزة الطرد المركزي مرة أخرى. أخيرا ، قم بتعقيم محلول ترانسفيرين الحديد 58 باستخدام مرشح حقنة 0.22 ميكرون ، وخزنه في أربع درجات مئوية حتى يصبح جاهزا للاستخدام.

تحضير 35 ملليغرام لكل ملليلتر من محلول ترانسفيرين الحديد-58 في محلول ملحي. ثم ضع فأرا حاملا مخدرا على وسادة تدفئة ، وقم بحقن محلول ترانسفيرين الحديد 58 ببطء وبعناية في الجيب المداري الرجعي. بعد ست ساعات من الحقن ، قم بالقتل الرحيم للفأر ، وقم بإزالة الرحم بعناية باستخدام ملقط معقم ومقص تشريح.

قطع وحدة مشيمة الجنين التي تتكون من جنين واحد ومشيمة في الكيس الأمنيوسي المحاط بجزء من الرحم. بعد ذلك ، قم بقطع الرحم والكيس الأمنيوسي بعناية دون إزعاج الجنين والمشيمة. ثم قشر الكيس الأمنيوسي وإزالة الجنين والمشيمة.

بعد قطع الحبل السري ، قم بمسح الجنين والمشيمة في مهمة نظيفة لإزالة السائل الأمنيوسي الزائد ، وتسجيل وزن المشيمة بأكملها. قطع كل المشيمة إلى النصف بشفرة حلاقة. ضع كل نصف في أنبوب سعة 2 ملليلتر ، وقم بتجميده في النيتروجين السائل.

لجمع كبد الجنين ، والتضحية بالجنين ، وتثبيت الجنين لتحقيق الاستقرار مع ترك البطن مكشوفا. باستخدام مقص التشريح ، قم بعمل شق صغير حيث تم توصيل الحبل السري. أدخل أحد طرفي مقص التشريح في الشق وقم بإجراء قطع مستوى متوسط 1/4 بوصة باتجاه المستوى الإكليلي.

ثم إجراء جروح مستعرضة لفضح كبد الجنين. باستخدام الملقط ، قم بإزالة كبد الجنين ، وسجل وزن كبد الجنين بأكمله. ضع كبد الجنين بالكامل في أنبوب سعة 2 ملليلتر وقم بتجميده في النيتروجين السائل.

قم بتخزين الأنسجة إلى أجل غير مسمى عند 80 درجة مئوية تحت الصفر. لتحديد كمية الحديد غير الهيم في المشيمة وكبد الجنين ، قم بإذابة نصفي المشيمة وكبد الجنين الكامل. ثم تزن نصفي المشيمة.

أضف 400 ميكرولتر من محلول ترسيب البروتين إلى عينات الأنسجة وقم بتجانس الأنسجة باستخدام الخالط الكهربائي. احتضان العينات عند 100 درجة مئوية لمدة ساعة واحدة. ثم قم بتبريدها في ماء بدرجة حرارة الغرفة لمدة دقيقتين.

افتح الأغطية لتحرير الضغط. ثم أغلق الأنابيب مرة أخرى. بعد طرد العينة بالطرد المركزي لحبيبات حطام الأنسجة, انقل المادة الطافية بعناية إلى أنبوب جديد مسمى لتحليل ICP-MS.

بجانب تحديد كمية حديد الهيم ، سجل وزن الحبيبات التي تم الحصول عليها بعد الطرد المركزي. ثم هضم الكريات في 10 ملليلتر من حمض النيتريك المركز بنسبة 70٪ ، مع استكمال ملليلتر واحد من 30٪ بيروكسيد الهيدروجين. سخني العينات إلى 200 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة قبل إرسالها لتحليل ICP-MS.

سمح قياس ICP-MS باكتشاف نظيرين مختلفين من الحديد. يعكس نظير الحديد الأكثر وفرة ، الحديد 56 ، التغيرات الأيونية المزمنة في الأنسجة. ويعكس نظير آخر، هو الحديد-58، التغيرات الحادة في توزيع الحديد المحقون.

أكد قياس الحديد-56 أن كبد الأجنة من حالات الحمل التي تعاني من نقص الحديد قد انخفضت مخازن الحديد مقارنة بتلك الموجودة في حالات الحمل المليئة بالحديد. أكد قياس الحديد-58 أنه في حالات الحمل التي تعاني من نقص الحديد، تم نقل كمية أقل من الحديد إلى كبد الجنين على مدى ست ساعات مقارنة بحالات الحمل المليئة بالحديد. أثناء تنفيذ الإجراء ، تذكر تسجيل وزن الأنسجة.

هذه الأوزان ضرورية لحساب تركيزات الحديد. نظرا لأن الحديد 58 لا يتطلب احتياطات خاصة للتعامل والتخلص ، يمكن استخدام الأنسجة غير المعالجة لإجراء تحليلات أخرى ، بما في ذلك ، على سبيل المثال لا الحصر ، النشاف الغربي ، أو qPCR.