قياس حركة احتشاد السطح البكتيري على ألواح التدرج المحفزة

يتتبع البروتوكول في وقت واحد استجابات الحشود البكتيرية لتركيزات محفزات مختلفة على أجار شبه صلب. ويتحقق ذلك بطريقة فعالة من حيث التكلفة. تنفي تقنية الفحص عالية الإنتاجية هذه الحاجة إلى أجار بتركيزات محفزة مختلفة لمراقبة الاستجابات الكيميائية الدقيقة.

تم تصميم هذه التقنية لفحص الأدوية وأيضا لمراقبة استجابات SD لمسببات الأمراض الدقيقة. أيضا ، يمكن استخدامه لدراسة الاستجابات الدقيقة لمختلف الإشارات الكيميائية الحيوية في المضيف البشري. يمكن أن توفر هذه الطريقة نظرة ثاقبة على التاكسي الكيميائي البكتيري.

سوف تستجيب البكتيريا لتركيزات مختلفة من الجاذبات الكيميائية المعروفة باسم chemotaxis الإيجابية أو المواد الطاردة الكيميائية المعروفة باسم chemotaxis السلبية. يعد الإعداد المعد بعناية ضروريا لتجنب الاختلافات بين زاوية الجل في الطبقة السفلية لمنع مشكلة التكاثر. للبدء ، ضع علامة على أطباق بتري 13 × 13 سم مربع مع البقع وأسماء المحرضات.

ثم ادعم الأطباق على حافة الأغطية. أضف محلول أرابينوز إلى وسط الطبقة السفلية الدافئ. أضف 40 ملليلتر من الطبقة السفلية الدافئة المتوسطة.

اسمح لوسط الطبقة السفلية بالشفاء المكشوف لمدة ساعة واحدة داخل غطاء التدفق الرقائقي دون عائق. بمجرد تصلب الطبقة السفلية بالكامل ، قم بإزالة الأغطية ووضع أطباق Petri داخل غطاء تدفق صفائحي. أضف 40 ملليلتر من وسط الطبقة العليا الدافئ باستخدام مرشح ماصة آلي.

عالج الألواح ذات الطبقة المزدوجة المغطاة وغير المضطربة لمدة ساعة واحدة ، ثم قم بتخزينها عند أربع درجات مئوية لمدة 24 ساعة. ضع الورق A4 المميز تحت لوحة تدرج صلبة جيدا. ادفع الجانب الأوسع من طرف ماصة سعة 100 ميكرولتر إلى السطح المتوسط شبه الصلب في الموضع المحدد واضغط على طرف الماصة حتى يصل إلى الجزء السفلي من وسط الطبقة العليا.

عندما يلمس الطرف الجزء السفلي ، توقف عن تطبيق أي قوة رأسية على الطرف وقم بتدوير الطرف برفق لعزل محتوى البئر الأسطواني. حرك طرف الماصة أفقيا على طول مسافة صغيرة للسماح بتدفق الهواء إلى المكان الضيق الموضوعة جانبا. اضغط على الطرف بإصبع السبابة لمنع تدفق الغاز داخل الطرف.

اسحب الطرف للخارج عموديا ، مع الحفاظ على محتوى البئر في الطرف أثناء سحبه للخارج. أضف 80 ميكرولتر من ثقافة النمو بين عشية وضحاها إلى كل بئر. أخرج ألواح السرب من الحاضنة واحدة تلو الأخرى كل 12 ساعة وضعها في نظام التصوير الهلامي.

حدد وضع التصوير الهلامي ، وقم بتعريض لوحة السرب للضوء الأبيض ، واضبط البعد البؤري للحصول على رؤية واضحة للأسراب. تعزيز سطوع الأسراب للمراقبة الدقيقة عن طريق ضبط وقت التعرض إلى 300 مللي ثانية. اضبط العتبة لتقليل التداخل من ضوء الخلفية.

احفظ ملف الصورة لمزيد من التحليل. سجل وقت التصوير ونوع المحفز واتجاه التدرج والسلالات في ملف txt. انقر على معالجة، ثم على الظلال لتحسين حدة الصورة.

انقر فوق العملية متبوعة بدفعة لمعالجة الصورة. ثم قم بمعالجة صورة كمرجع بالنقر فوق عملية وظلال وجنوب. انقر فوق معالجة، دفعة، ماكرو لفتح نافذة العملية الدفعية.

ابحث عن الأوامر المعروضة في النافذة. اكتب عنوان مجلد الصور الأصلية في عنوان ملف الإخراج بالنقر فوق عملية في النافذة عملية الدفعية. استخدم أداة تتبع العصا لتحديد الأسراب بشكل فردي وانقر نقرا مزدوجا فوق أداة تتبع العصا لضبط التسامح حتى يتناسب الخط الذي تم إنشاؤه مع حدود السرب بشكل صحيح.

انقر على تحليل، ثم قياس لتصدير قيمة المنطقة. تم اختبار E.coli K12 YdeH على ألواح تدرج أرابينوز المستخدمة لإثبات عملية احتشاد السطح مع التداخل الذي يحدث بين الآبار المجاورة. مكنت لوحة تحتوي على ثلاثة آبار اختبار من تشكيل حدود غير متداخلة.

تم تعزيز حركة الاحتشاد P.aeruginosa PAO1 YdeH مع زيادة تركيز أرابينوز من أدنى تركيز ، ولكن تم تقييده تدريجيا بتركيزات أعلى من أرابينوز. أظهرت سلالات E.coli K12 من النوع البري التي تم اختبارها على ألواح تدرج ريسفيراترول ضمن نطاق تركيز صفر إلى 400 ميكرولتر تقييدا متواضعا لحركية الاحتشاد مع زيادة تركيز ريسفيراترول. تم تحديد مناطق السرب كميا بواسطة برنامج ImageJ.

عرض منحنى الاحتشاد استجابات التركيز المتعددة. الجزء الأكثر أهمية في هذا الإجراء هو تصنيع لوحة سرب مزدوجة الطبقة مع نطاق تركيز محدد من المحرضات. تمكن هذه الطريقة الباحثين من التحقيق في احتشاد السطح المستحث ضمن نطاق تركيز محدد وتحديد آثار المحفزات والمكونات الأخرى على الاحتشاد.