بروتوكول نمذجة الأروميات البشرية تطوير وزرع الكيسة الأريمية

إن البحوث المتعلقة بالأجنة البشرية محدودة بسبب قلة توافرها وشواغلها الأخلاقية، وبالتالي فإن الحصول على نماذج فردية تكرر بأمانة التنمية البشرية المبكرة من شأنه أن يدعم التقدم العلمي والطبي. تعتمد قدرة هذه التقنية على التنبؤ بالتنمية البشرية على قدرتها على إعادة إنتاج تسلسل التحديد الخلوي للكيسة الأريمية وتشكيلها بشكل فعال ، وفقا للتسلسل التنموي والوتيرة ، ومن شأن هذه النمذجة أن تضمن تكوين خلايا تعكس حقا مرحلة الكيسة الأريمية. في المستقبل ، يمكن استخدام الأروميات البشرية لتحديد الأهداف العلاجية والمساهمة في النمذجة قبل السريرية ، على سبيل المثال ، لتحسين وسط الإخصاب في المختبر ، أو لتطوير وسائل منع الحمل غير الهرمونية.

وسيشارك في هذا الإجراء هارونوبو كاغاوا، وألوك جافالي، وحيدر حيدري خوئي، وتيريزا ماريا سومر، وجيوفاني سيستيني. للبدء، قم بإعداد وسائط PXGL وتسخينها مسبقا والوسائط القاعدية N2B27 والمخزن المؤقت للغسيل وPBS ووسائط التجميع. استبعاد MEFs من تعليق hPSC لتشكيل الأروميات.

لاستبعاد MEF ، قم بإعداد صفيحة مغلفة بالجيلاتين عن طريق إضافة ملليلتر واحد من 0.1٪ من الجيلاتين إلى بئر صفيحة من ستة آبار. احتضن الألواح عند 37 درجة مئوية لمدة 30 إلى 90 دقيقة. لحصاد الخلايا ، قم بإزالة الوسط ، واغسل الخلايا بملليمتر واحد من PBS.

أضف 500 ميكرولتر من محلول انفصال الخلايا إلى كل بئر من صفيحة من ستة آبار ، واحتضنها عند 37 درجة مئوية لمدة خمس دقائق. تحقق من الخلايا تحت المجهر لمتابعة تفكك المستعمرات إلى خلايا واحدة. تمييع محلول انفصال الخلايا مع ملليلتر واحد من الغسيل العازل.

جمع الخلايا من اللوحة عن طريق سحب بلطف من خمس إلى 10 مرات. انقل تعليق الخلية إلى أنبوب 15 ملليلتر. قم بتدوير الخلايا عند 200 RCF لمدة أربع دقائق.

قم بإزالة السوبرناتانت ، وأعد تعليق الخلايا في 1.5 ملليلتر من وسط PXGL في كل بئر. زرع الخلايا على الألواح المغلفة بالجيلاتين لاستبعاد MEF ، واحتضن الألواح عند 37 درجة مئوية لمدة 60 إلى 90 دقيقة. بمجرد أن يتم زرع الخلايا الساذجة لاستبعاد MEF ، قم بإزالة PBS من MicroWells وقم بموازنة الآبار مع 200 ميكرولتر من وسط N2B27 القاعدي لكل شريحة MicroWell ، واحتضنها لمدة 60 دقيقة عند 37 درجة مئوية.

جمع supernatant التي تحتوي على الخلايا الساذجة غير المرفقة. انقله إلى أنبوب 15 ملليلتر ، وقم بتدوير الخلايا عند 200 RCF لمدة أربع دقائق. تخلص من الوسائط، وأعد تعليق الخلايا في ملليلتر واحد من الوسائط القاعدية N2B27.

عد الخلايا باستخدام شرائح عد الخلايا. قم بتدوير الخلايا عند 200 RCF لمدة أربع دقائق. تخلص من الوسط ، وأضف كمية مناسبة من وسائط N2B27 التي تحتوي على 10 ميكرومولار Y27632 للحصول على كثافة خلية تبلغ 30000 خلية لكل 50 ميكرولتر.

قم بإزالة الوسط من صفائف MicroWell المتوازنة ، وأضف 25 ميكرولتر من وسائط N2B27 مع 10 ميكرومولار Y27632. أضف 50 ميكرولترا من تعليق الخلايا ، واحتضنها عند 37 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة للسماح للخلايا بالسقوط في قاع MicroWell. ثم أضف 125 ميكرولتر من N2B27 المتوسطة ، مع استكمال 10 ميكرومولار Y27632.

في غضون 24 ساعة ، سيتم ملاحظة مجاميع من hPSCs الساذجة على شريحة MicroWell. بدء تشكيل البلاستويد عن طريق إعداد وسط PALY. قم بتسخينه مسبقا عند 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة.

قم بإزالة وسط التجميع ، وأضف 200 ميكرولتر من وسط PALY المسخن مسبقا إلى MicroWells. ضع صفيحة زراعة الخلايا مرة أخرى في حاضنة نقص الأكسجة عند 37 درجة مئوية. كرر تغيير الوسائط في اليوم الأول.

في اليوم الثاني ، قم بإزالة وسط PALY ، وأضف 200 ميكرولتر من وسط N2B27 ، مع استكمال LPA و 10 ميكرومولار Y27632. كرر تغيير الوسائط في اليوم الثالث. يحدث تكوين الأروميات الكامل بحلول اليوم الرابع.

قم بإعداد تعليق خلية hPSC ساذج لتشكيل الأروميات كما هو موضح سابقا. تخلص من الوسط ، وأضف كمية مناسبة من وسائط N2B27 التي تحتوي على 10 ميكرومولار Y27632 للحصول على كثافة الخلايا من 70 خلية لكل 100 ميكرولتر من الوسط. لتجميع الخلايا في قاع الآبار ، قم بالطرد المركزي للصفيحة عند 200 RCF لمدة دقيقتين في درجة حرارة الغرفة.

احتضان اللوحة عند 37 درجة مئوية في ظل ظروف ثقافة نقص الأكسجة. في غضون 24 ساعة ، سيتم ملاحظة مجاميع من hPSCs الساذجة على الآبار. أضف 100 ميكرولتر من البئرين الطازجة والمسخنة مسبقا مرتين إلى الآبار.

ضع صفيحة زراعة الخلايا مرة أخرى في حاضنة نقص الأكسجة عند 37 درجة مئوية. بعد 24 ساعة ، تخلص من نصف الوسائط ، واستبدلها ب 100 ميكرولتر من وسط PALY المسخن مسبقا. كرر الخطوة حتى اليوم الرابع.

قم بإعداد تعليق خلية HPSC ساذج لتشكيل التروبوسفير كما هو موضح سابقا. بمجرد تشكيل مجاميع من HPSCs الساذجة بعد 24 ساعة ، تبادل وسط التجميع مع PALY بدون LIF ، مع استكمال ثلاثة ميكرومولار SC144 لتشكيل الغلاف الغذائي الذي يمثل الأديم التغصني المبكر. لتشكيل الأديم الغاذجي الذي يمثل الأديم الغافوري الناضج ، استبدل وسط التجميع مع PALY ، مع استكماله باثنين من XMUMP1 ميكرومولار.

قم بتحديث الوسط يوميا. يحدث تكوين الغلاف الغاذي الكامل بحلول اليوم الرابع. لتقييم حالات الخلية، قارن البيانات النسخية من الأروميات والغلاف الغاذي مع الضوابط المناسبة، بما في ذلك الخلايا الجذعية الغاذية البشرية الشبيهة بالزرع بعد الزرع.

تم تجميع وتجويف هياكل hPSCs الساذجة المستزرعة في PXGL التي ظهرت بين 48 إلى 72 ساعة بعد تحريض PALY ، ووصل قطرها إلى 150 إلى 250 ميكرومتر في غضون 96 ساعة. استنادا إلى المعلمات المورفومترية ووجود السلالات الثلاث ، وصلت كفاءة الحث إلى 70 إلى 80٪ من التروفوسفير بكفاءة 50 إلى 60٪ في غضون 96 ساعة من الحث. كان تكوين البلاستويد ناجحا في لوحات 96 بئر منخفضة التعلق المتاحة تجاريا في ظل ظروف الحث المحسنة.

تم استخدام تقنية تسلسل الحمض النووي الريبي أحادي الخلية لتوصيف حالة الخلية الأرثوبية بشكل أكبر. تعرض الخلايا ملفات تعريف تجميع متميزة بشكل ملحوظ ، بغض النظر عن المعلمات المستخدمة لإجراء تجميع البيانات وتصورها ، مما سمح بتمييز سلالات الكيسة الأريمية الثلاثة بثقة. بين 24 و 60 ساعة ، تشكل الخلايا الجذعية متعددة القدرات PXGL نظائرها من الأبلاست والأديم الغذائي.

ثم بين 60 و 96 ساعة ، يتم تشكيل نظائرها من الأديم القطبي ، والأديم الباطن البدائي. هذا هو تسلسل المواصفات داخل الكيسة الأريمية ، وبالتالي فإن الأروميات تلخص التسلسل التنموي لمواصفات النسب. أظهر دمج مجموعات بيانات الأروميات مع مجموعة البيانات المرجعية للخلايا المعزولة من الأجنة في مراحل مختلفة من التطور أن 97٪ من الخلايا من الأروميات تتجمع مع خلايا الكيسة الأريمية ، ولكن ليس مع خلايا من أجنة ما بعد الزرع.

وأكد تحليل مستقل أنه مع مرور الوقت، شكلت الخلايا الجذعية خلايا تتطابق نسخيا مع خلايا الأجنة البشرية بين اليوم الخامس و7.5. هذه هي في الواقع مرحلة النمو التي تتشكل خلالها الكيسة الأريمية البشرية. كما أكدوا أن أكثر من 95٪ من الخلايا داخل الأروميات لديها نسخة تتطابق مع سلالات الخلايا الثلاث من الكيسة الأريمية ، في حين أن 3٪ من الخلايا كانت خارج الهدف ، وتتطابق مع مراحل ما بعد الزرع.

تجدر الإشارة إلى أننا لاحظنا أن ثقافاتنا الأولية ثنائية الأبعاد تضم أيضا حوالي 5٪ من الخلايا المستهدفة. يمكن أيضا تصور مرحلة النمو المكافئة من خلال النظر إلى أنماط التعبير لعلامات محددة مثل CDX2 للأديم التغذي للأديم الأريمي ، و PRMD14 لأوبلاستروم الكيسة الأريمية. تعد جودة ثقافة PXGL الأولية أمرا بالغ الأهمية ، كما أن عدد الخلايا داخل التجميع الأولي أمر بالغ الأهمية أيضا ، ويمكن التحكم فيه باستخدام MicroWells.

يجب أن يكون الحجم الإجمالي للركام الخلوي بعد 24 ساعة حوالي 50 إلى 70 ميكرومتر. إن التكوين الفعال للأروميات الكاملة المرحلة يمهد الطريق لدراسة عمليات الزرع وتطوير الجنين البشري بعد الزرع.