تحديد توزيع طول سلسلة الجلوكان للجليكوجين باستخدام طريقة الرحلان الكهربائي للكربوهيدرات بمساعدة الفلوروفور (FACE)

في هذا البروتوكول ، يتم استخدام تقنية الرحلان الكهربائي للكربوهيدرات بمساعدة الفلوروفور (FACE) لتحديد توزيع طول السلسلة (CLD) ومتوسط طول السلسلة (ACL) للجليكوجين.

توفر هذه الطريقة فهما أفضل للمنظمات الهيكلية لجزيئات الجليكوجين. إنها قضية مهمة لأن سكان سلاسل الجلوكان ، ما يسمى توزيع طول السلسلة ، يحدد الخصائص الكيميائية الفيزيائية لجزيئات الجليكوجين. مثل الذوبان في الماء.

إحدى المزايا الرئيسية لهذه التقنية هي أن التألق ثابت بغض النظر عن طول سلسلة الجلوكان. هناك جزيء APTS واحد فقط مرتبط بالجلوكان. وبالتالي ، فإن شدة التألق تتناسب طرديا مع عدد سلاسل الجلوكان.

مجال الرحلان الكهربائي الشعري المساعد مناسب لحل الآلية الطبية لإنزيمات استقلاب الجليكوجين. على سبيل المثال ، يمكننا تحديد درجة بلمرة سلاسل الجلوكان المنقولة عن طريق تفرع الإنزيمات على الجلوكان المقبول. يجب إجراء التفاعل في ظروف.

لذلك ، يجب حماية المناطق من الرطوبة. امزج 200 ميكرولتر من 0.5-2 ملليغرام لكل ملليلتر من الجليكوجين النقي مع 200 ميكرولتر من 100 خلات عازلة من الرقم الهيدروجيني 4.8. أضف 2 ميكرولتر من الأيزواميلاز ، و 1.5 ميكرولتر من بولولاناز.

اخلطي بلطف عن طريق السحب لأعلى ولأسفل. ثم احتضن عند 42 درجة مئوية لمدة 16 ساعة في أنبوب 1.5 ملليلتر. أوقف التفاعلات عن طريق الحضانة عند 95 درجة مئوية لمدة 5 دقائق.

جهاز طرد مركزي في 16 ، 100 مرة G'لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة لحبيبات وإزالة أي مادة غير قابلة للذوبان. قم بإزالة الصيانة الفائقة باستخدام ماصة ونقلها إلى أنابيب مشروحة جديدة. بعد إضافة حبات الراتنج إلى أنبوب الفيوج الصغير الفارغ ، قم بإزالة الملح من المواد الفائقة عن طريق إضافة ما يعادل 100 ميكرولتر من حبات راتنج تبادل الكاتيون الأنيون وتحريكها.

جمع العينات عن طريق السحب ، ووضعها في أنابيب مشروحة جديدة. تجميد تجفيف العينات. تخزين العينات المجففة في درجة حرارة الغرفة أو 20 درجة مئوية.

امزج العينات المجففة مع 2 ميكرولتر من 1 سيانوبوروهيدريد الصوديوم المولي و Tetrahydrofuran ، و 2 ميكرولتر من 8 أحماض أمينية 1-3-6 بيرين ثلاثي سلفونيك. تحضن عند 42 درجة مئوية لمدة 16 ساعة في الظلام. أضف 46 ميكرولتر من الماء النقي للغاية إلى كل عينة.

لتخفيف العينات 50 مرة ، أضف ميكرولتر واحد من العينة إلى 49 ميكرولتر من الماء النقي للغاية في 100 ميكرولتر ميكروفيال. في دوامة لتخلط جيدا. ضع العينات في الظلام لمدة 5 إلى 10 دقائق أثناء ضبط الوجه.

لإجراء الرحلان الكهربائي للقطبية العكسية ، قم بإعداد الطريقة ، واضبط ضغط الحقن على قوة 0.5 رطل لكل بوصة مربعة. ثم اضبط القطبية على الوضع العكسي للفصل. قم بتخفيف المخزن المؤقت لفصل الكربوهيدرات المرتبط ب N إلى الثلث في الماء النقي للغاية.

قم بإجراء فصل الجلوكان المسمى APTS في المخزن المؤقت المخفف عند 30 كيلوفولت في شعيرة شعرية من السيليكا العارية المنصهرة. ثم قم بإعداد وقت الحقن ، وابدأ التحليل. تصدير ملفات ASC و CDF التي تحتوي على ملف تعريف الفيروغرام الكهربائي وبيانات التكامل على التوالي.

افتح ملف ASC وارسم وحدة التألق النسبية وفقا للمخطط الزمني. افتح ملف CDF. تابع أول تكامل تلقائي واضبط المعلمات التالية مع تكامل الوادي إلى الوادي والحد الأدنى للمساحة.

تحقق من أي حدث تكامل غير لائق وقم بتصحيحه يدويا. نشأت إشارات التألق التي لوحظت بين 4.13 و 4.67 دقيقة من APTS غير المتفاعلة. قدر الوقت الألوطي للمالتوهيكساوس DP 6 المسمى ب 8.49 دقيقة.

تم تحديد APTS المسمى Glucans من الجليكوجين البقري بناء على الوقت الألوطي ل DP 6. لم يتم الكشف عن أي أثر للمالتوليغوساكاريد الحر في عينة التحكم التي لم يتم فيها احتضان الجليكوجين مع إنزيمات إزالة التفرع. تعرض اللوحة الداخلية فصلا بين سلاسل Glucan حتى 44 DP. يظهر توزيع طول السلسلة كنسبة مئوية من DP لكل DP. تم حساب متوسط طول السلسلة عن طريق جمع كل نسبة مئوية من أضعاف السلسلة الدرجة المقابلة من البلمرة.

أظهر تحليل الوجه أن الجلوكان الأكثر وفرة هي المالتوز وكبد الأرانب ، ومالتوهيكساوس في المحار ، ومالتوهيبتاوز في الكبد البقري. تم تحديد توزيعات طول السلسلة من الجليكوجين المنقى من النوع البري والسلالات البكتيرية الزرقاء المتحولة باستخدام تحليل الوجه. تم إجراء تحليلات الطرح عن طريق طرح النسبة المئوية لكل DP من النوع البري من النسبة المئوية لكل DP من المتحورات.

تم تطبيع متوسط توزيعات طول السلسلة من الجليكوجين من النوع البري والطفرات من Synechocystis وفقا للذروة القصوى التي لوحظت لكل CLD. تسمح هذه التقنية بفهم أفضل للأمراض البشرية المرتبطة بخلل في استقلاب الجليكوجين ، وخاصة مرض أندرسن ، وهي نتائج غنية من تراكم جزيئات الجليكوجين غير الطبيعية في الخلايا.