استراتيجية فعالة لتشخيص اللعاب باستخدام روبوتات السحب العكسي الكمية ل SARS-CoV-2 باستخدام روبوتات السحب مفتوحة المصدر

لقد طورنا اختبارا وسير عمل منخفض التكلفة قائما على اللعاب يعتمد على اللعاب ويسهل تنفيذه وتوسيع نطاقه لتطبيقات الفحص المجتمعي واسعة النطاق. هنا نستخدم روبوتات مناولة السوائل مفتوحة المصدر وأجهزة تدوير الحرارة القياسية والبرامج لإجراء اختبار مباشر للعاب دون استخراج أو تثبيت المخازن المؤقتة مع الاستمرار في توفير نتائج تشخيصية دقيقة. بسبب سير العمل المتوازي الآلي البسيط ، يمكن توسيع نطاق النظام لإجراء آلاف الاختبارات يوميا مع الحد الأدنى من متطلبات المعدات والمساحة والموظفين.

بالإضافة إلى كايلي كينغ ، ستساعد راشيل هام ، المشرفة على المختبر السريري لدينا وأوستن سموذرز منسق التعليم لدينا ، في إظهار الإجراء ابدأ بتطهير الجزء الخارجي من أنابيب جمع اللعاب بنسبة 70٪ من الإيثانول ونقلها إلى المختبر للاختبار. سجل وصول العينة عن طريق مسح كل نموذج من الباركود في جدول بيانات المدخول اليومي. عالج عينات المسح الحراري لمدة 30 دقيقة في فرن 95 درجة مئوية ثم قم بإزالة العينات باستخدام قفازات مقاومة للحرارة.

افتح جداول بيانات تحميل العينة اليومية لكل روبوت تحميل عينة في محطة تعيين العينة. ثم قم بتعيين 188 عينة لكل لوحة بئر 384. صواني الملصقات مع اسم اللوحة والتاريخ ورقم الربع.

امسح العينات ضوئيا بالترتيب في جدول بيانات تحميل العينة. في محطة تحميل العينات ، اصطف مجموعتين كاملتين من ثمانية رفوف مطبوعة 3D ، تتوافق مع وضع سطح السفينة في الروبوت. قم بفك أنابيب الربع الأول ووضعها في رفوف مطبوعة ثلاثية الأبعاد ، بدءا من الموضع A1 في الرف الأول.

املأ كل رف من اليسار إلى اليمين ومن الأعلى إلى الأسفل. استمر في نمط التحميل هذا في الرف الثاني ، ثم انتقل إلى الرفوف الرابعة والخامسة. ضع رفوف عينة ربع محملة على الطوابق واحد ، اثنان ، أربعة ، خمسة ، سبعة ، ثمانية ، 10 ، 11.

ضع نصائح P20 على الطوابق الثالثة والتاسعة. لتبسيط عملية الإعداد، قم بتحميل المواد من الخلف إلى الأمام في الروبوت. يتم إنتاج لوحات المزيج الرئيسية على روبوت مخصص وتخزينها عند أربع درجات مئوية.

يتم استخدام لوحة واحدة في كل مرة ويتم تصنيفها باسم اللوحة ، ويتم استخدام شفرة حادة لقطع خط في الرقائق حول آبار التحكم. ضع لوحة الخلط الرئيسية على السطح السادس وقشر غطاء الرقائق ، تاركا وراءه المستطيل الصغير الذي يغطي آبار التحكم. اكشف عن صناديق الأطراف وأغلق الروبوت.

قم بتهيئة بروتوكول تشغيل Python المخصص بالنقر فوق بدء التشغيل من خلال تطبيق سطح المكتب الروبوت. يستغرق كل ربع سنة 24.5 دقيقة للتحميل على اللوحة. قم بتعيين مؤقت كتذكير.

أثناء تشغيل الروبوت ، قم بفك الغطاء وتحميل ربع أنبوبين للعينة في المجموعة الثانية من الرفوف المطبوعة 3D. عندما يتوقف الروبوت مؤقتا، قم بإزالة الرفوف ربع الأولى واستبدلها بربع رفوفين، ثم انقر على استئناف التشغيل في تطبيق سطح المكتب. قم بتلخيص ربع واحد من أنابيب العينة وتخزينها في ثلاجة بأربع درجات مئوية أثناء انتظار النتائج.

كرر عملية التحميل هذه للربعين الثالث والرابع. انقل اللوحة المحملة إلى خزانة السلامة الحيوية. لتقليل التلوث، حافظ على تغطية اللوحة أثناء النقل.

جمع أي عينات متكررة وتعيينها كآخر العينات في الربع الرابع. قم بترقم العينات ومسح الباركود ضوئيا وأدخل موقع العينة الأصلي والنتيجة في جدول بيانات تحميل العينة. انقل العينات المتكررة إلى خزانة السلامة الحيوية.

لا تقم بتحميل أنابيب العينة المتكررة في رفوف تحميل الروبوت. ماصة ميكرولترين من كل عينة متكررة إلى الآبار الصحيحة. استخدم الماصة المخصصة لإضافة عينات المرضى.

حافظ على تغطية آبار التحكم بالرقائق المعدنية، مع إضافة عينات لتقليل التلوث. قشر غطاء الرقائق فوق آبار التحكم باستخدام الملقط. ماصة ميكرولترين من عينات المرضى الإيجابية المؤكدة في الآبار M23 و M24.

ماصة ميكرولترين من المياه الخالية من النوكليز إلى الآبار N23 إلى N24 واثنين من الميكرولترات من 200 نسخة لكل ميكرولتر التحكم الإيجابي المختلط إلى الآبار O23 إلى O24. اترك الآبار P23 إلى P24 فارغة لمراقبة جودة دفعة المزيج الرئيسي. قم بتغطية اللوحة بختم شفاف بصريا واستخدم بكرة قضيب للالتصاق بالختم لجميع الآبار.

دوامة اللوحة في 2،500 دورة في الدقيقة لمدة 30 ثانية لخلط جيدا ، ثم الطرد المركزي لوحة في 500 مرة G لمدة دقيقة واحدة. حدد برنامج البروتوكول في برنامج التدوير الحراري واحفظ البروتوكول للألواح المستقبلية. ضع اللوحة المختومة في جهاز التدوير الحراري وقم بتشغيل البروتوكول.

تصدير قيم CT ونسخ القيم إلى نموذج تحميل جدول البيانات. للتحكم الإيجابي ، تحقق مما إذا كان هناك عنصر تحكم إيجابي واحد على الأقل ينتج قيم CT بين 22 و 28 لكل من تحقيقات P1 و N1. وبدلا من ذلك، تنتج آبار العينات الإيجابية المعروفة قيم P1 و N1 CT أقل من 33 في مجسات P1 و N1.

للتحكم السلبي ، تحقق من عدم وجود قيم N1 أو P1 CT في أي من بئري التحكم السلبيين. تأكد من أن قيم التصوير المقطعي المحوسب لها منحنيات تضخيم صالحة قبل إبطال اللوحة. إذا أنتج P1 نتيجة للتصوير المقطعي المحوسب أقل من 33 ، ففكر في البئر كما هو صالح وانتقل إلى النتيجة من N1. إذا كان P1 ينتج نتيجة للتصوير المقطعي المحوسب أكبر من أو يساوي 33 أو لا قيمة التصوير المقطعي المحوسب ، ففكر في البئر غير صالح.

إذا كان N1 ينتج نتيجة CT أقل من 33 ، فقم بتقييم البئر بنعم. إذا لم ينتج N1 قيمة CT ، فقم بتقييم البئر لا. إذا كان N1 ينتج قيمة CT أكبر من أو تساوي 33 ، فقم بتقييم البئر أو عدم وجود نجم.

تأكد من أن جميع قيم N1 CT مقترنة بمنحنى تضخيم حقيقي. إذا كانت قيمة CT ل N1 ليس لها منحنى تضخيم ، فإن البئر لا. حدد العينات المتكررة، وقم بتصنيفها برقم عينة داخلي ونوع العينة وإعادتها إلى سير عمل التحميل.

تظهر الصور التمثيلية اكتشاف RTQ PCR للحمض النووي الريبي الاصطناعي N1 أو SARS CoV-2 والحمض النووي الاصطناعي P1 أو HSRPP30. تم رسم المنحنيات القياسية مع الانحرافات المعيارية لتحديد نطاق الكشف الدقيق باستخدام هذا المزيج التمهيدي للمسبار. تم رسم متوسط قيم CT التي تم الحصول عليها في التخفيفات ذات الصلة مقابل الكمية المقدرة من الحمض النووي الريبي الاصطناعي والحمض النووي الاصطناعي.

في كلتا الحالتين ، أظهرت المنحنيات الخطية معاملات ارتباط جيدة عبر مجموعة واسعة من تركيزات النسخ الجينية. تم نقل قيم N1 CT التي تم الحصول عليها من عينات فريدة باستخدام كل من تحميل العينة الروبوت واليدوي لتحديد التباين بين الفحص بين التحميل اليدوي والروبوت. أنتجت العلاقة الخطية بين الطرق اليدوية والآلية معامل ارتباط مرتفع يشير إلى أن كلتا الطريقتين متكافئتان وظيفيا.

كما تم تحديد تباين المقايسة الداخلية باستخدام قيم N1 CT التكرارية المنقولة التي تم الحصول عليها من كل من الروبوت وتحميل العينات اليدوي. يظهر هنا تقييم طرق المعالجة الحرارية لتقليل اللزوجة في اللعاب. تم جمع اللعاب السلبي SARS CoV-2 من مصدر واحد وتم معالجة aliquots بالحرارة إما لمدة صفر دقيقة أو 30 دقيقة أو 60 دقيقة عند 95 درجة مئوية.

تم رسم قيم P1 CT من النسخ المتماثلة التقنية لكل حالة لتحديد التباين بين طرق العلاج. أنتجت كل من طرق المعالجة الحرارية لمدة 30 دقيقة و 60 دقيقة انخفاضا كبيرا في تباين العينة مقارنة بعدم التحكم في المعالجة. لم يكن هناك فرق كبير بين 30 دقيقة و 60 دقيقة العلاجات.

لذلك تم تنفيذ طريقة المعالجة الحرارية لمدة 30 دقيقة لتقليل وقت المعالجة. استخدم تقنية التعقيم المناسبة لتقليل تلوث لوحات الاختبار ، خاصة عند تحميل العينات اليدوية وعناصر التحكم. تجنب عبور الطبق بيديك أو أكمامك.

بعد إنتاج النتائج السريرية، يمكن التخلص من العينات في نفايات المخاطر البيولوجية أو يمكن حفظها لمزيد من التحليل، مثل تسلسل الجينوم الكامل لتحديد سلالات معينة. تسمح هذه التقنية بإجراء اختبارات مجتمعية واسعة النطاق ، مما يسمح لنا بالتحقيق في آثار تغطية الاختبار والانتشار غير العرضي ل Covid 19.