عزل النواة منخفضة الإدخال وتعدد الإرسال باستخدام الأجسام المضادة المشفرة للعقد الودية للفأر لتسلسل الحمض النووي الريبي أحادي النواة
مارس 23, 2022
يصف هذا البروتوكول إعداد العينة المفصلة والمنخفضة المدخلات لتسلسل النواة الواحدة، بما في ذلك تشريح العقد العنقية والنجمية المتفوقة للفأر، وتفكك الخلايا، والحفظ بالتبريد، وعزل النواة، والترميز الشريطي للوسوم.
في بروتوكول JoVE هذا ، نستخدم تسلسل الحمض النووي الريبي أحادي النواة القائم على القطيرات لتوصيف البنية البيولوجية للخلايا العصبية الودي القلبية في الصحة والمرض. تمكن هذه الطريقة من تسلسل مجموعة كبيرة من العينات العصبية على مدى فترة من الزمن. من خلال سحب النوى المشفرة باستخدام علامات التصنيف oligos ، تسمح هذه الطريقة بتعدد الإرسال للعينات.
تحمل هذه الطريقة إمكانية توسيعها لتشمل تسلسل الخلايا العصبية للعقد البشرية ، والتي كانت صعبة بسبب حجم خليتها الكبير وصعوبة جمع العينات في وقت واحد. سيوضح الإجراء كوني فان مونستيرين ، فني أبحاث ، و Lieke van Roon ، طلاب الدكتوراه من مختبرنا ابدأ بجمع جميع المواد اللازمة للتشريح ، ثم قم بإصلاح الماوس على لوحة التشريح. بلل الماوس بالإيثانول بنسبة 70٪ لتقليل تشتت الفراء.
افتح جلد منطقة الرقبة عن طريق إجراء قطع خط الوسط بالمقص. تحت المجهر الاستريو ، حرك الغدد تحت الفك السفلي جانبا وأزل عضلة الخشاء القصية لفضح الشريان السباتي المشترك وتشعبه ، وكذلك العقد العنقية العليا وإزالة الأنسجة المرتبطة به. تشريح تشعب الشريان السباتي الأيمن والأيسر والأنسجة المرتبطة به.
انقل كل قطعة من الأنسجة المشوهة إلى طبق بتري منفصل بطول 3.5 سم يحتوي على PBS بارد. حدد موقع العقد العنقية العليا المرتبطة بتشعب الشريان السباتي. تنظيف العقد العنقية العليا عن طريق إزالة الشريان والأنسجة المرفقة.
لتشريح العقد النجمية ، قم بعمل قطع خط الوسط في البطن ، يليه فتح الحجاب الحاجز والجدار الصدري البطني. إزالة الرئتين ، تليها القلب ، لفضح الصدر الظهري. على مستوى الضلع الأول ، حدد موقع العقد النجمية اليسرى واليمنى الأمامية الجانبية للعضلة القولونية الطويلة.
تشريح كل من العقد النجمية مع ملقط عن طريق إزالة الأنسجة المحيطة. انقلها إلى أطباق بتري بطول 3.5 سم تحتوي على PBS بارد. باستخدام الملقط ، انقل العقد العنقية المتفوقة والعقد النجمية لفصل أنابيب الطرد المركزي الدقيقة سعة 1.5 ملليلتر ثم أضف 500 ميكرولتر من محلول Trypsin-EDTA بنسبة 0.25٪ إلى كل أنبوب واحتضنه في حمام مائي يهتز.
اسمح للعقد بالاستقرار في الجزء السفلي من أنابيب أجهزة الطرد المركزي الدقيقة. انقل السوبرناتانت إلى أنبوب سعة 15 ملليلتر يحتوي على خمسة ملليلتر من وسط العقدة. إلى أنابيب أجهزة الطرد المركزي الدقيقة ، أضف 500 ميكرولتر من محلول الكولاجيناز من النوع 2 واحتضنه في حمام مائي يهتز.
بعد الحضانة ، أعد تعليق العقد في محلول الكولاجيناز عن طريق السحب حتى لا يتم اكتشاف كتل الأنسجة. انقل تعليق الخلية إلى أنبوب 15 ملليلتر المستخدم سابقا والذي يحتوي على وسط زراعة العقد مع تعليق Trypsin-EDTA. الطرد المركزي لتعليق الخلية والتخلص من الخلية الخارقة.
أعد تعليق الكريات في 270 ميكرولتر من مصل البقر الجنيني وانقله إلى 1 ملليلتر من التبريد. لحساب الخلايا ، امزج 5 ميكرولترات من تعليق الخلايا العقدية مع خمسة ميكرولترات من صبغة زرقاء تريبان بنسبة 0.4٪. قم بتحميل الخليط في مقياس للخلايا الدموية واحسب إجمالي أعداد الخلايا الحية تحت المجهر.
بعد ذلك ، أضف 30 ميكرولتر من ثنائي ميثيل سلفوكسيد إلى كل تبريد واخلطه جيدا. انقل الكريوفيالات إلى حاوية لتجميد الخلايا وضعها عند 80 درجة مئوية تحت الصفر بين عشية وضحاها. تحضير أنابيب 15 ملليلتر مع مصفاة 30 ميكرومتر في الأعلى.
قبل شطف المصفاة مع 1 ملليلتر من وسط العقدة. أخرج الكريوفيالات من النيتروجين السائل وقم بإذابتها على الفور في حمام مائي عند 37 درجة مئوية حتى يتم ترك حبيبة صغيرة من الجليد في التبريد. أضف 1 ملليلتر من وسط العقدة إلى كل مبرد مع هز القارورة بعناية لاستعادة الخلايا العقدية.
قم بتحميل تعليق الخلايا العقدية على المصفاة وشطفه ب 4 إلى 5 ملليلتر من وسط العقدة. جهاز الطرد المركزي لتعليق الخلية المتوترة. قم بإزالة supernatant وإعادة تعليق الخلايا في 50 ميكرولتر من المخزن المؤقت لغسل الخلايا.
انقل تعليق الخلية إلى أنبوب طرد مركزي صغير منخفض الارتباط سعة 0.5 ملليلتر. جهاز الطرد المركزي لتعليق الخلية. جهاز طرد مركزي مع دوار دلو متأرجح ضروري من الآن فصاعدا.
بعد الطرد المركزي ، قم بإزالة 45 ميكرولتر من supernatant دون إزاحة بيليه الخلية. أضف 45 ميكرولتر من المخزن المؤقت للتحلل المبرد ، ممزوجا بلطف عن طريق السحب ، واحتضن الخلايا لمدة 8 دقائق على الثلج ، ثم أضف 50 ميكرولتر من المخزن المؤقت لغسل النوى الباردة إلى كل أنبوب. الطرد المركزي لتعليق النوى وإزالة 95 ميكرولتر من supernatant دون تعطيل بيليه النوى.
أضف 45 ميكرولتر من المخزن المؤقت لغسل النوى المبردة إلى الكريات ، وكرر الطرد المركزي ، وأزل السوبرناتانت. إلى حبيبات النواة ، أضف 50 ميكرولتر من ST-SB وماصة بلطف حتى يتم إنعاش النوى بالكامل ، ثم أضف 5 ميكرولترات من كاشف منع FC واحتضنها لمدة 10 دقائق على الجليد. بعد ذلك ، أضف 1 ميكرولتر من الأجسام المضادة أحادية النواة واحتضنها لمدة 30 دقيقة على الجليد.
بعد الحضانة ، أضف 100 ميكرولتر من ST-SB إلى كل أنبوب. الطرد المركزي للتعليق وإزالة 145 ميكرولتر من supernatant دون تعطيل بيليه النوى. كرر الطرد المركزي وإزالة supernatant.
أعد تعليق حبيبات النوى في 50 ميكرولتر من ST-SB واخلطها بلطف. خذ 5 ميكرولترات من تعليق النوى وامزجها مع 5 ميكرولترات من 0.4٪ من أزرق التربان لحساب النوى تحت المجهر. مرة أخرى ، قم بالطرد المركزي لتعليق النوى وإعادة تعليق حبيبات النوى في ST-SB لتحقيق تركيز نووي مستهدف من 1000 إلى 3000 نواة لكل ميكرولتر.
اسحب العينات لتحقيق العدد المطلوب من الخلايا. أظهر تحليل مراقبة الجودة لإعداد المكتبة أن cDNAs المشتقة من الوسم oligo أصغر من 180 زوجا أساسيا. تمثل الذروة الواسعة من 300 إلى 1000 زوج أساسي مكتبة تعبير جيني عالية الجودة ، في حين أظهرت ذروة محددة من 194 زوجا أساسيا مكتبة الهاشتاج oligo.
كشف تحليل تسلسل الحمض النووي الريبي أحادي النواة عن 12 مجموعة تم تصورها بواسطة UMAP وتم توزيع الأجسام المضادة للوسم بين جميع المجموعات. تم تأكيد وضع علامات محددة بواسطة علامة التصنيف oligos من خلال تعبير Xist. علامات التصنيف 1 إلى 4 وصفت الإناث ، في حين أن 5 إلى 8 عينات الذكور المصنفة.
تم التحقق من جودة ودقة بيانات التسلسل بواسطة النصوص الرئيسية مثل TH و DBH و SNAP25 في المجموعتين 5 و 7 للخلايا العصبية المتعاطفة ، و S100B في المجموعات من 0 إلى 3 للخلايا الدبقية الساتلية ، و PECAM 1 في المجموعة 4 للخلايا البطانية ، و ACTA2 في المجموعة 8 للخلايا اللحمية . عند محاولة هذه الطريقة ، من المهم أن تتذكر التحضير السليم والمعدات المناسبة مثل مقص التشريح الدقيق والملقط الحاد وأجهزة الطرد المركزي مع دوار دلو متأرجح ضرورية. النهج التدريجي لتسلسل الحمض النووي الريبي أحادي النواة للعقد القلبية الخارجية الودية لديه القدرة على التطبيق الواسع في توصيف العقد التي تعصب الأعضاء والأنسجة الأخرى ذات الصلة في الصحة والمرض.
اعرض النص الكامل واحصل على الوصول إلى آلاف الفيديوهات العلمية
النظرة العامة
يحدد هذا البروتوكول طريقة تحضير عينة منخفضة المدخلات لتسلسل النواة المفردة، مع التركيز على الخلايا العصبية القلبية الوديَّة. يتضمن خطوات مفصلة مثل التشريح، تفكيك الخلايا، وعزل النواة.
مكونات الدراسة الرئيسية
مجال العلم
- علم الأعصاب
- تسلسل النواة المفردة
- الخلايا العصبية القلبية الوديّة
الخلفية
- يسمح تسلسل الحمض النووي الريبي للنواة المفردة بتحليل العينات العصبية.
- تعتبر هذه الطريقة مفيدة بشكل خاص لدراسة البنية البيولوجية للعصبونات.
- توجد تحديات في تسلسل الخلايا العصبية الأكبر من العقد اللمفاوية البشرية.
- الترميز باستخدام الجزيئات الأولية ذات العلامات التصنيفية يتيح تعدد العينات.
هدف الدراسة
- لتوصيف الخلايا العصبية القلبية الوديّة في الصحة والمرض.
- لتطوير بروتوكول لتحضير عينة منخفضة المدخلات.
- لتسهيل تسلسل النوى العصبية.
الطرق المستخدمة
- تسلسل الحمض النووي الريبي للنواة المفردة المعتمد على القطرات.
- تشريح العقد اللمفاوية العنقية العليا والنجمية للفأر.
- تقنيات تفكيك الخلايا والحفظ بالتبريد.
- عزل النواة والترميز باستخدام العلامات التصنيفية للتعدد.
النتائج الرئيسية
- العزل الناجح للنوى من الخلايا العصبية القلبية الوديّة.
- تبيان البروتوكول من قبل فنيي البحث وطلاب الدكتوراه.
- الإمكانية المحتملة لتوسيع الأسلوب ليشمل الخلايا العصبية من العقد اللمفاوية البشرية.
- فهم محسن للهياكل العصبية في مختلف الظروف.
الخلاصات
- يوفر البروتوكول طريقة موثوقة لتسلسل النواة المفردة.
- يفتح سبلاً للبحث المستقبلي حول العينات العصبية البشرية.
- تحسن تقنيات الترميز من كفاءة تحليل العينات.
الأسئلة الشائعة
Executive Industry Relevance
Single-nucleus RNA sequencing of low-input mouse sympathetic ganglia enables high-resolution molecular profiling of neuronal and non-neuronal cell types relevant to cardiac innervation. This protocol supports multiplexed sample analysis and long-term preservation, addressing key bottlenecks in nervous system target validation and mechanistic de-risking for cardiovascular disease models. The approach enhances predictive confidence at the discovery and preclinical interface for neuro-cardiac research portfolios.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables molecular characterization of sympathetic ganglia in both healthy and disease states.
- Supports functional target validation by resolving neuronal, glial, and endothelial cell populations.
- Facilitates mechanistic de-risking for neuro-cardiac therapeutic hypotheses.
- Improves predictive confidence for prioritizing targets in autonomic nervous system research.
Screening & Assay Development
- Provides validated nuclei isolation and barcoding workflows for reproducible sample multiplexing.
- Delivers quantitative, cell-type-resolved transcriptomic outputs for downstream assay development.
- Enables scalable preparation of high-quality nuclei libraries for screening platforms.
- Supports reliable evaluation of compound effects on diverse ganglionic cell types.
Translational & Preclinical Research
- Aligns molecular profiling with disease-relevant models of cardiac innervation and remodeling.
- Maintains sample integrity for longitudinal and multi-cohort studies.
- Facilitates continuity from discovery through preclinical validation in neuro-cardiac pipelines.
- Supports risk-adjusted advancement decisions based on cell-type-specific transcriptomic data.
Pipeline & Workflow Integration
This protocol integrates into the discovery-to-preclinical continuum for neuro-cardiac research, enabling multiplexed, quantitative analysis of sympathetic ganglia at key inflection points.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification in cardiac autonomic regulation.
- Screening: Provides reproducible nuclei isolation and barcoding for assay-ready sample preparation.
- Analytics: Delivers quantitative transcriptomic readouts and cell-type clustering for comparative analyses.
- Translational Research: Enables alignment with disease models and biomarker discovery in cardiac innervation studies.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable workflow for profiling ganglia from multiple organs and experimental conditions.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in neuro-cardiac target validation.
- Operational Value: Standardizes nuclei isolation, barcoding, and multiplexing for scalable, reproducible workflows.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions and capital efficiency by enabling robust, multi-sample analyses.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of neuro-cardiac therapeutic programs.
Implementation Considerations
- Requires expertise in dissection, nuclei isolation, and single-nucleus sequencing workflows.
- Needs access to specialized equipment such as swinging bucket centrifuges and droplet-based sequencing platforms.
- Demands rigorous cross-team standardization for sample handling and barcoding procedures.
- Adaptable to other ganglia and organ systems with protocol optimization.
- Dependent on high-quality nuclei preparation and library QC for reliable downstream analysis.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Introduction
0:59
Dissection of Adult Mouse Superior Cervical Ganglia
2:12
Dissection of Adult Mouse Stellate Ganglia
2:57
Isolation and Cryopreservation of Mouse Ganglionic Cells
4:56
Nucleus Isolation
6:50
Nucleus Barcoding with Hashtag Oligos and Multiplexing
8:24
Results: Quality Control Analysis of Single-Nucleus cDNA Library Preparation and snRNA-Sequencing
9:55
Conclusion
