إزالة موقع بدء انتقالي داخلي من mRNA مع الاحتفاظ بالتعبير عن البروتين كامل الطول
مارس 16, 2022
يصف البروتوكول الحالي طفرة M213L واحدة في Gja1 تحتفظ بجيل Connexin43 كامل الطول ولكنها تمنع ترجمة الشكل الأصغر GJA1-20k المترجم داخليا.
تكمن الصعوبة في استبدال بقايا واحدة في التنميط الجيني للحيوانات بكفاءة على الرغم من الاختلاف في البقايا المفردة. يضيف الاستخدام الخاص لإنزيم التقييد خطوة واحدة وسريعة ومنخفضة التكلفة فقط إلى التنميط الجيني النموذجي القائم على تفاعل البوليميراز المتسلسل. يمكن تطبيق هذا البروتوكول على أي نموذج ماوس آخر مع نقطة طفرة إذا تم التعرف على التسلسل المستهدف بواسطة إنزيم تقييد ، وهو ما يحدث عادة.
قطع واحد إلى ثلاثة ملليمترات من طرف الذيل مع مقص نظيف ونقله إلى أنبوب PCR 0.2 ملليلتر ثمانية شرائط. بعد احتواء عينة الذيل كما هو موضح في المخطوطة ، قم بتخزينها عند T-ناقص 20 درجة مئوية حتى الاستخراج ، حتى حوالي أسبوع. أضف 100 ميكرولتر من محلول تحلل الأنسجة لكل أنبوب واخلطها جيدا ، متبوعا بالدوران لأسفل باستخدام جهاز طرد مركزي صغير على الطاولة عند 2،200 مرة من G لمدة 10 ثوان في درجة حرارة الغرفة.
تأكد من غمر عينات الذيل في المحلول. اضبط الأنابيب على جهاز تدوير حراري يتم تعيينه عن طريق برمجة معلمات تحلل الأنسجة وتعطيلها والاحتفاظ بها. قم بتخزين الأنسجة عند أربع درجات مئوية لمدة تصل إلى أسبوع إذا تعذر إجراء تفاعل البوليميراز المتسلسل على الفور.
قم بإعداد محلول PCR يحتوي على خمسة ميكرولترات من الماء الخالي من النوكليز ، و 0.75 ميكرولتر من 10 ميكرومولات إلى الأمام والخلف. أضف ميكرولتر واحد من محللات الأنسجة المعدة مسبقا إلى محلول PCR. امزج محلول تفاعل البوليميراز المتسلسل جيدا وقم بالدوران لأسفل باستخدام جهاز طرد مركزي صغير على الطاولة بسرعة 2 ، 200 مرة G لمدة 10 ثوان في درجة حرارة الغرفة.
اضبط الأنابيب على جهاز تدوير حراري مبرمج. بمجرد اكتمال التفاعل ، قم بتخزين منتجات PCR عند أربع درجات مئوية لمدة شهر إلى شهرين أو ما يقرب من عام واحد عند 20 درجة مئوية تحت الصفر. تحضير محلول الإنزيم الذي يحتوي على سبعة ميكرولترات من الماء الخالي من النوكليز ، وميكرولترين من المخزن المؤقت CutSmart بقوة 10X ، وميكرولتر واحد من إنزيم تقييد NlaIII.
إذا كان هناك عدة عينات ، فاضرب كل محتوى لصنع الخليط و aliquot 10 ميكرولتر لكل أنبوب. أضف 10 ميكرولترات من منتج PCR الذي تم الحصول عليه مسبقا إلى محلول الإنزيم لكل أنبوب. اخلطي جيدا ودلكي لأسفل مع جهاز الطرد المركزي الصغير على الطاولة كما هو موضح سابقا.
اضبط الأنابيب على جهاز تدوير حراري مبرمج أو كتلة حرارية. تخزين المنتج بعد الحضانة في ظل ظروف باردة. أضف 0.75 جرام من الأغاروز في 50 ملليلتر من المخزن المؤقت TAE أحادي القوة.
اخلطي الأغاروز وسخنيه في الميكروويف حتى يذوب تماما. بعد تبريده ، أضف خمسة ميكرولترات من بقعة الحمض النووي واخلطها بلطف. صب 25 ملليلتر من هلام الأغاروز في قالب الجل واسمح للهلام بالتصلب.
قم بتحميل 10 ميكرولترات من منتج PCR المهضوم إلى البئر. قم بتشغيل الجل بجهد 100 فولت لمدة 35 دقيقة. صورة هلام الأغاروز تحت الأشعة فوق البنفسجية.
أدى الرحلان الكهربائي الأغاروز الذي تم إجراؤه باستخدام منتج PCR المهضوم إلى عدة نطاقات بأحجام مختلفة في كل نمط وراثي ، مع نطاقين في النوع البري ، وثلاثة في متغايرة الزيجوت ، وواحد في متماثل الزيجوت ، على التوالي. أدى اختبار الحقن مع تحليل الكيسة الأريمية إلى معدل نجاح 76.9٪ في حقن 50 نانوغرام لكل ميكرولتر من الأوليغوس المانحة ، ومعدل نجاح 25٪ في حقن 25 نانوغرام لكل ميكرولتر من نفس أوليجو المانحة ، على التوالي. وأخيرا ، فإن حقن 50 نانوغرام لكل ميكرولتر من الأوليغوس المانحة مع هطول الأمطار الإيثانول حصل على الحيوانات المؤسسة بمعدل نجاح 50 ٪.
أدى تنقية المتبرعين بالأوليغو عن طريق هطول الأمطار بالإيثانول إلى خفض السمية مع الحفاظ على كفاءة تحرير الجينوم العالية. التعامل الدقيق وإضافة كمية منخفضة من الكواشف مهم جدا. تأكد من إضافتها بشكل صحيح وخلطها جيدا.
اعرض النص الكامل واحصل على الوصول إلى آلاف الفيديوهات العلمية
نظرة عامة
يوضح هذا البروتوكول طريقة لإجراء التنميط الجيني للحيوانات التي تحمل طفرة M213L مفردة في جين Gja1، والتي تؤدي إلى إنتاج بروتين Connexin43 كامل الطول مع منع ترجمة النظير البروتيني الأصغر GJA1-20k. وتؤكد هذه الطريقة على كفاءة وفاعلية التكلفة لاستخدام إنزيمات القطع في التنميط الجيني القائم على تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR).
مكونات الدراسة الرئيسية
مجال البحث
- علم الوراثة
- البيولوجيا الجزيئية
- النماذج الحيوانية
خلفية علمية
- أهمية تحديد الطفرات الجينية
- تحديات استبدال الأحماض الأمينية المنفردة
- تطبيق إنزيمات التقييد في التنميط الجيني
الطرق المستخدمة
- التنميط الجيني القائم على تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR)
- نماذج الفئران التي تحتوي على طفرات نقطية
- الترحيل الكهربائي لهلام الأجاروز لتحليل DNA
النتائج الرئيسية
- تحديد ناجح للأنماط الجينية ذات أنماط النطاقات المميزة
- معدلات نجاح عالية في إنتاج الحيوانات المؤسسة
- تحقق من كفاءة الطرق الموصوفة للتحليل الجيني
الاستنتاجات
- توضح الدراسة بروتوكولاً فعالاً لتنميط الطفرات الجينية في نماذج الفئران.
- تساهم الدراسة بمنهجيات قيمة للأبحاث الجينية في علم الأحياء النمائي.
الأسئلة الشائعة
الأهمية التنفيذية للصناعة
يتيح هذا البروتوكول تحديد الأنماط الجينية بدقة للطفرات النقطية في نماذج الفئران، مما يدعم دراسات التحقق من الأهداف التي تتطلب تحليل التعبير البروتيني النوعي للأشكال المتماثلة. ومن خلال التخلص من الأشكال المتماثلة المبتورة المسببة للارتباك مع الحفاظ على وظيفة البروتين كامل الطول، يعزز هذا النهج من تقليل المخاطر الميكانيكية في مراحل الاكتشاف المبكرة. كما يعمل هذا الأسلوب على تحسين الثقة التنبؤية للفرضيات العلاجية المتعلقة ببيولوجيا Connexin 43 ومسارات الفجوات الموصلة ذات الصلة.
التطبيقات الاستراتيجية في البحث والتطوير في مجال الأدوية البيولوجية
الاكتشاف المبكر والتحقق من الهدف
- القيمة العلمية: تتيح استجواب الفرضيات العلاجية من خلال عزل المساهمة الوظيفية لبروتين Cx43 كامل الطول عن الأشكال الإسوية المبتورة من الطرف النيتروجيني (N-terminal).
- القيمة التشغيلية: توفر طريقة تحديد نمط جيني قابلة للتطوير للتمييز بين الأليلات من النوع البري، والمتغايرة الزيجوت، والطافرة متماثلة الزيجوت في المجموعات الكبيرة.
- القيمة التنبؤية: تدعم فرز المحفظة البحثية من خلال توضيح ما إذا كانت الأنماط الظاهرية الملحوظة ناتجة عن فقدان البروتين كامل الطول أو عن آليات خاصة بالأشكال الإسوية.
الفحص وتطوير المقايسة
- جاهزية المقايسة: تُنتج عينات DNA بأنماط قطع تقييدية مناسبة لتدفقات عمل الفحص عالي الإنتاجية.
- المخرجات الكمية: تتيح القياس الكمي المحدد للأليل عبر تحليل تعدد أشكال طول القطع التقييدية بواسطة PCR.
- قابلية التكرار: توحد عملية التنميط الجيني عبر المختبرات باستخدام إضافة إنزيم واحد منخفض التكلفة إلى بروتوكولات PCR الموجودة.
الأبحاث الانتقالية وما قبل السريرية
- الارتباط المرضي: يسهل تطوير النماذج قبل السريرية التي تساهم فيها عملية نقل Cx43 وتجميع الوصلات الفجوية في الاضطرابات القلبية أو العصبية أو الأورام.
- الاستمرارية الترجمية: يربط النمط الجيني الجزيئي بالنتيجة المظهرية من خلال الحفاظ على تعبير Cx43 كامل الطول مع تقليل GJA1-20k.
- القرارات المعدلة حسب المخاطر: يوجه معايير المتابعة أو الإيقاف (go/no-go) من خلال تمكين ربط مستويات تعبير الأشكال المتعددة (isoform) مع القراءات الوظيفية في الجسم الحي (in vivo).
تكامل مسار العمل وسير العمل
تندرج هذه الطريقة ضمن نطاق عملية الاكتشاف، بدءاً من التحقق الأولي من الهدف وصولاً إلى اختبار الفعالية في المرحلة قبل السريرية، لا سيما عندماما يلزم تحديد وظائف البروتينات الخاصة بنوع متماثل معين.
- بيولوجيا الاكتشاف: تدعم اختبار الفرضيات من خلال تمكين النماذج الجينية التي تفرق بين وظيفة البروتين كامل الطول ونشاط الأشكال المتشابهة المبتورة.
- الفحص: توفر حمض DNA جينومي جاهز للمقايسة للتطبيقات اللاحقة مثل التحقق من CRISPR أو إدارة مستعمرات التربية.
- التحليلات: توفر أنماط نطاقات واضحة وقابلة للتسجيل على هلام الأجاروز تتيح التحديد السريع للنمط الجيني دون الحاجة إلى التسلسل.
- الأبحاث الانتقالية: تمكن الدراسات قبل السريرية حيث يكون تموضع غشاء Cx43 والتواصل بين الخلايا من النقاط الميكانيكية النهائية الرئيسية.
- إعادة الاستخدام المؤسسي: قابلة للتكيف مع أي طفرة نقطية حيث يمكن إدخال موقع تقييد أو تعطيله، مما يوفر منصة قابلة لإعادة الاستخدام لتحديد الأنماط الجينية.
التأثير التشغيلي والمؤسسي
- القيمة العلمية: يقلل من الغموض الميكانيكي في التحقق من الهدف من خلال عزل المساهمات الخاصة بكل شكل إيزوفورمي.
- القيمة التشغيلية: يزيد من الإنتاجية ويقلل التكلفة لكل عينة عبر خطوة واحدة لهضم التقييد بعد عملية الـ PCR.
- القيمة الاستراتيجية: يعزز الثقة في اتخاذ القرار أثناء تحسين المركبات الرائدة من خلال توضيح العلاقات بين النمط الجيني والنمط الظاهري.
- التأثير على المحفظة: يتيح التقدم المدروس للمرشحات التي تستهدف المسارات المعتمدة على Cx43 مع تعديل المخاطر.
اعتبارات التنفيذ
- يتطلب خبرة في البيولوجيا الجزيئية في تصميم بادئات PCR واختيار إنزيمات القطع.
- يعتمد على توفر أجهزة الدورات الحرارية، وأنظمة الفصل الكهربائي لهلام الأغاروز، ومعدات التصوير بالأشعة فوق البنفسجية UV.
- يستلزم توحيد معايير تحلل الأنسجة وظروف PCR بين المستخدمين لضمان اتساق النتائج.
- يعتمد التكيف مع أنظمة نماذج بديلة على سياق التسلسل وتوافق إنزيمات القطع.
- يقتصر على الطفرات التي تغير أو تنشئ موقع تعرف لإنزيم القطع؛ وقد تتطلب الطفرات الصامتة استراتيجيات بديلة.
