المحاكاة القائمة على البنية وأخذ عينات من حركات بروتين عامل النسخ على طول الحمض النووي من الخطوة على النطاق الذري إلى الانتشار الخشن الحبيبات

الهدف من هذا البروتوكول هو الكشف عن الديناميكيات الهيكلية لنشر البروتين أحادي البعد على طول الحمض النووي ، باستخدام عامل النسخ النباتي WRKY مجال البروتين كنظام مثالي. تكشف المحاكاة الذرية في إطار بناء نموذج حالة ماركوف عن حركات خطوة بمقدار 1 نقطة أساس للبروتين على طول الحمض النووي في التفاصيل الذرية. في حين تركز عمليات المحاكاة ذات الحبيبات الخشنة على أخذ عينات من الانتشار العملي للبروتين على مدى 10 من نقاط أساس على طول الحمض النووي.

للبدء ، استخدم مسار MD كامل الذرة 10 ميكروثانية لاستخراج 10،000 إطار بالتساوي إلى الأمام ، ومسار خطوة زوج قاعدة واحد. قم بإعداد مسار الانتقال باستخدام 10000 إطار في VMD بالنقر فوق ملف وحفظ الإحداثيات. ثم اكتب البروتين أو النواة في المربع الذرات المحددة.

اختر إطارات في مربع الإطارات، وانقر حفظ للحصول على الإطارات المطلوبة. قم بمحاذاة المحور الطويل للمرجع من البنية البلورية للحمض النووي إلى المحور x، واضبط المركز الأولي لكتلة الحمض النووي المكون من 34 زوجا أساسيا كاملا في أصل مساحة الإحداثيات بالنقر فوق الملحقات ثم تحديد TkConsole في VMD. بعد ذلك، اكتب الأمر في نافذة الأوامر TkConsole.

بعد ذلك، احسب الجذر يعني المسافة المربعة للعمود الفقري للبروتين بالنقر فوق VMD، ثم انتقل إلى الملحقات، وانقر فوق تحليل، وحدد أداة مسار RMSD. في مربع اختيار الذرة، اكتب النواة والبقايا من 14 إلى 23، ومن 46 إلى 55. انقر فوق محاذاة ثم مربع RMSD.

لحساب درجة دوران البروتين حول الحمض النووي ثيتا تي ، مع تحديد الموقع الزاوي الأولي باسم ثيتا 0 ، على مستوى XY في MATLAB ، قم بتنفيذ الأمر. أدخل التعليمات الواردة في MATLAB لاستخدام طرق K-means ، وصنف الهياكل 10،000 إلى 25 مجموعة. بمجرد الانتهاء من ذلك ، اجمع هياكل المراكز العنقودية ال 25 لمزيد من محاكاة MD.

لإجراء محاكاة MD من الجولة الأولى ، قم ببناء نظام ذري للهياكل ال 25 باستخدام GROMACS ، وملف sh لنظام البناء. قم بإجراء محاكاة MD لمدة 60 نانوثانية للأنظمة ال 25 في إطار مجموعة NPT مع خطوة زمنية من اثنين من الفيمتو ثانية عن طريق معالجة الأمر في shell. لتجميع مسارات MD للجولة الأولى ، قم بإزالة أول 10 نانو ثانية من كل مسار محاكاة وجمع التأكيدات من مسارات 25 في 50 نانو ثانية.

لتحليل المكونات المستقلة للوقت، أدخل البرنامج النصي في GROMACS، متبوعا باختيار أزواج المسافة بين البروتين والحمض النووي كإسقاط لمعلمات الإدخال. من الفهرس. ملف ndx، إلى فهرس ملف نصي جديد.dat.

للحصول على معلومات الزوج بين هذه الذرات، استخدم برنامج Python النصي. حساب أزواج المسافة 415 من كل مسار في نافذة الأمر MSMBuilder. بعد ذلك ، قم بإجراء تحليل مكون مستقل عن الوقت لتقليل بعد البيانات على أول مكونين أو متجهين مستقلين عن الوقت عن طريق تنفيذ الأمر.

باستخدام معالجة التعليمات في MSMBuilder، قم بتجميع مجموعات البيانات المسقطة في 100 مجموعة باستخدام طريقة مركز الحالة وحدد بنية المركز لكل مجموعة. لإجراء محاكاة MD من الجولة الثانية ، قم بإجراء محاكاة MD لمدة 60 نانوثانية بدءا من 100 هيكل أولي. بعد فرض سرعات أولية عشوائية على جميع الذرات، أضف السرعات الأولية العشوائية عن طريق تشغيل توليد السرعة في ملف MDP.

قم بإزالة أول 10 نانو ثانية من كل محاكاة كما هو موضح سابقا. وجمع 2،500،000 لقطة من مسارات 100 في 50 نانو ثانية ، بالتساوي ، لبناء MSM. لتجميع مسارات MD للجولة الثانية، قم بإجراء تحليل مكون مستقل عن الوقت لمسارات الجولة الثانية في MSMBuilder كما هو موضح.

وحساب مقياس الوقت الضمني للتحقق من صحة المعلمات عن طريق تنفيذ البرنامج النصي بايثون. بعد ذلك ، قم بتغيير وقت التأخر تاو وعدد الحالات الدقيقة عن طريق تغيير المعلمات. تصنيف التأكيدات إلى 500 مجموعة عن طريق تنفيذ الأمر.

بالنسبة لبناء MSM ، قم بتجميع 500 حالة صغيرة في ثلاث إلى ست حالات ماكرة. لمعرفة عدد الحالات الكلية التي تناسبك بشكل أفضل ، وفقا لخوارزمية PCCAplus في MSMBuilder باستخدام البرنامج النصي Python. ارسم خريطة للتأكيدات عالية الأبعاد إلى X وزاوية دوران البروتين على طول الحمض النووي لكل حالة دقيقة.

لحساب متوسط أوقات المرور الأولى ، قم بإجراء خمسة مسارات مونت كارلو 10 مللي ثانية ، استنادا إلى مصفوفة احتمال الانتقال ل 500 MSM في الحالة الدقيقة مع تعيين وقت التأخر البالغ 10 نانو ثانية كخطوة زمنية لمونت كارلو. حساب متوسط أوقات المرور الأولى بين كل زوج من الحالات الكلية داخل البرنامج النصي Python ومتوسط الخطأ القياسي لمتوسط مرات المقطع الأول باستخدام ملف Bash. في برنامج CafeMol 3.0 ، قم بتشغيل المحاكاة الحبيبية للدورة التدريبية عن طريق تنفيذ الأمر على المحطة الطرفية.

بعد تحديد الكتل في ملف الإدخال ، قم بتعيين كتلة أسماء الملفات وكتلة job_cntl باستخدام الأوامر الفردية. بعد ذلك ، قم بتعيين كتلة unit_and_state ، متبوعة بتعيين كتلة energy_function وكتلة md_information. تم تعيين جميع تأكيدات البروتين على الحمض النووي إلى الحركة الطولية X وزاوية دوران البروتين على طول الحمض النووي ، والتي يمكن تجميعها بشكل أكبر في ثلاث حالات ماكرو.

حالة S1 أقل ملاءمة لأن الروابط الهيدروجينية تشبه البنية النموذجية ، في حين يشير S3 إلى حالة غير مستقرة حيث تحولت جميع الروابط الهيدروجينية بعد خطوة زوج قاعدة واحدة وبدت مستقرة مع أعلى عدد من السكان بنسبة 63٪ الحالة الوسيطة S2 يربط S1 و S3 مع عدد سكان مرتفع متوسط يبلغ 30٪ يسمح انتقال S2 إلى S3 بكسر جماعي وإصلاح الروابط الهيدروجينية في حوالي سبعة ميكروثانية ، في حين أن الانتقال من S1 إلى S2 يمكن أن يحدث في حوالي 0.06 ميكروثانية. تم حساب أرقام الاتصال بين البروتين والحمض النووي وتم تحديد أربع حالات. في الحالتين 1 و 3 ، ترتبط منطقة إصبع الزنك باتجاه Y.

بينما في الحالتين 2 و 3 ، ترتبط منطقة إصبع الزنك باتجاه Y. تم قياس حجم الخطوة لكل بقايا محفوظة على تسلسلات مختلفة من الحمض النووي ، مما كشف عن أن أحجام الخطوات لهذه المخلفات متزامنة بشكل أكبر على الحمض النووي polyA من تسلسل الحمض النووي العشوائي polyAT. تتمثل الخطوات المهمة في بناء نموذج حالة ماركوف في اختيار أزواج المسافة بين إصلاحات بيانات البروتين والحمض النووي في حركات الخطوة 1-bp ، واختيار عدد مناسب من الحالات الدقيقة والحالات الكلية.