التطهير البصري للأنسجة النباتية للتصوير الفلوري

يمكن أن تكون هذه الطريقة مفيدة في تصوير النبات بأكمله للكشف عن المورفولوجيا السليمة والعمليات التنموية والتفاعلات بين النبات والميكروبات. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنه يمكننا مراقبة الجزء الداخلي من جسم النبات مباشرة دون إلحاق الضرر به. نظرا لأن هذه الطريقة تنطبق على مجموعة واسعة من الأنواع والأنسجة النباتية ، فإنها يمكن أن تساعد في تسريع اكتشاف ظواهر جديدة في البحوث البيولوجية النباتية.

التثبيت هو خطوة حاسمة في هذا الإجراء. قبل خطوة المقاصة ، يحتاج المرء إلى التحقق من شدة البروتين الفلورسنت بعد التثبيت. البدء في غمر عينات النبات في المحلول المثبت في أنبوب صغير ، والتأكد من أن حجم المحلول المثبت أكثر من خمسة أضعاف حجم العينة.

ختم الأنبوب الصغير مع parafilm وجعل ثقوب باستخدام إبرة. ضع الأنبوب الصغير في مجفف واضبط ببطء درجة الفراغ إلى حوالي 690 ملليمتر من الزئبق بحيث تظهر الفقاعات تدريجيا من العينات. أوقف تشغيل مضخة التفريغ بعد إخلاء المجفف.

تنفيس المجفف بعناية دون إزعاج العينات. قم بتشغيل مضخة التفريغ مرة أخرى وقم بإيقاف تشغيلها بعد إخلاء المجفف. افتح المجفف بعناية دون أن تصطدم بالمحلول المثبت في الأنبوب الصغير.

قم بإزالة المحلول المثبت وإضافة 1x PBS باستخدام ماصة صغيرة. بعد التخزين لمدة دقيقة واحدة ، استبدل PBS القديم ب 1x PBS جديد. بعد إزالة PBS بخمسة أضعاف حجم عينة محلول المقاصة ، قم بإغلاق الأنبوب الصغير باستخدام parafilm وقم بعمل ثقوب بإبرة.

ضع العينات في المجفف. قم بإخلاء مضخة التفريغ وإيقاف تشغيلها. افتح المجفف بلطف ، ثم أغلق الأنبوب الدقيق.

قم بعكس الأنبوب الصغير ، كل يوم إلى يومين لتسريع عملية التطهير. بالنسبة لإطار الفاصل ، قم بقطع ورقة مطاطية من السيليكون باستخدام شفرة حلاقة لضبط سمك ورقة مطاط السيليكون وفقا لسمك العينة. ضع إطار السيليكون على زجاج غطاء ، ثم ضع العينات المعالجة داخل الإطار وأضف حوالي 100 ميكرولتر من محلول المقاصة لإزالة أي فقاعات.

يغطى بزجاج غطاء آخر لمنع تبخر محلول المقاصة. راقب العينات تحت المجهر الفلوري. بعد الملاحظة ، أعد العينات إلى محلول التطهير في أنبوب صغير.

تم احتضان الأوراق الثابتة من أنواع مختلفة في PBS أو ClearSee لمدة ثمانية أيام ، في ClearSee أو ClearSeeAlpha لمدة يومين. يمكن ل ClearSee مسح أوراق الأنواع المختلفة. بعد استخراج البشرة ، يمكن ل ClearSee مسح أوراق الأرز.

نظرا لأن مكون كبريتيت الصوديوم في ClearSeeAlpha يمنع أكسدة البوليفينول بسبب التأثير المختزل ، يمكن ل ClearSeeAlpha إزالة التبغ ومدقات تيرانيا دون أي تصبغ بني. تم التعامل مع أوراق المروج Ubiquitin-10 H2B-mClover من أرابيدوبسيس ثاليانا باستخدام PBS أو ClearSee لمدة ثلاثة أيام. قلل علاج ClearSee من اللون الأخضر الشاحب لورقة أرابيدوبسيس H2B-mClover وعزز كثافة التألق ل H2B-mClover مقارنة بحضانة PBS.

لوحظت الأوراق المعالجة من ClearSee بواسطة مجهر الإثارة ثنائي الفوتون مع إثارة 950 نانومتر. جدار الخلية ملطخ بالكالكافلور الأبيض. يتم تصنيف النوى مع مروج يوبيكوتين-10 ، H2B-mClover.

الصور Y Z و X Z هي مقاطع عرضية في الموضع المشار إليه بالخطوط البيضاء المتقطعة. يعد إعداد الحل المثبت مهما لإصلاح العينات. ومع ذلك ، ينبغي توخي الحذر لمنع تلف العينات تحت الفراغ.

يمكن إجراء التصوير المجهري لدراسة أنماط التعبير الجيني المتعددة والاتصالات داخل الخلايا أثناء تطور النبات والعدوى بعد هذا الإجراء.