Name: طريقة تلطيخ مزدوج للكشف عن البكتين في التفاعل بين النبات والفطريات (فيديو) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-02-04T15:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 39 s
Description: اكتشف طريقة التلطيخ المزدوج للكشف عن البكتين في تفاعلات النبات والفطريات باستخدام المجهر الضوئي. تُمكّن هذه التقنية من تحديد هياكل الفطريات وعيوب جدار الخلية بدون معدات مكلفة.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

يود المؤلفون أن يشكروا الدكتور هدسون دبليو بي دي كارفالهو على الدعم لتطوير هذا العمل. كما أعرب المؤلفون عن امتنانهم لمختبر المجهر الإلكتروني "البروفيسور إليوت واتانابي كيتاجيما" لتوفيره مرفق الفحص المجهري الضوئي. يشكر المؤلفون الدكتور فلافيا رودريغز ألفيس باتريسيو على تزويد المواد النباتية بالآفات.

1. إعداد محلول التخزين المؤقت والكواشف
<ol><li>تحضير 2 M كاكوديلات المخزن المؤقت عن طريق إضافة 4.28 غرام من كاكوديلات الصوديوم إلى 100 مل من الماء المقطر وضبط الرقم الهيدروجيني إلى 7.25 مع 0.2 N HCl.</li>
	<li>تحضير 100 مل من محلول كارنوفسكي المثبت عن طريق خلط 10 مل من 25٪ غلوتارالدهيد المائي ، 10 مل من الفورمالديهايد المائي 10٪ ، 25 مل من 2 متر كاكوديليت المخزن المؤقت ، و 0.5 مل من 0.5 م كاكل226. تشكل الحجم إلى 100 مل بالماء المقطر. ملاحظة: يمكن الاحتفاظ بالمحلول في الثلاجة لمدة 6 أشهر. تنبيه: محلول التخزين المؤقت الكاكوديليت سام. لذلك ، تعامل مع الحل المثبت في غطاء الدخان أو منطقة مفتوحة. تجنب استنشاق أبخرة المحلول وارتداء القفازات أثناء المناولة.</li>
	<li>تحضير محلول المغذيات المائية Hoagland عن طريق خلط ما يلي: 3 mM Ca(NO 3) 2.4H2O ، 2 mM NH 4 H 2 PO 4 ، 5 mM KH 2 PO 4 ، 2 mM MgSO 4.7H 2 O ، 9.07 mM MnSO 4 ، 0.765 mM ZnSO 4.7H 2 O، 46.4 mM H 3 BO 3 ، 0.09 mM Na2MoO4. H2O و 0.01 mM CuSO 4 و 36 mM FeSO4.7H 2O مثل الحديد-EDTA (حمض الإيثيلين ديامين رباعي الأسيتيك) 27.</li>
</ol>2. عينات نباتية وتلقيح الفطريات
ملاحظة: بالنسبة للتجارب على الأوراق المتأثرة بصدأ القهوة ، خمس شتلات عمرها 2 شهر من Coffee arabica cv. تم زراعة Catuaí والاحتفاظ بها في دفيئة في مركز الطاقة النووية في الزراعة (CENA) بجامعة ساو باولو ، بيراسيكابا ، ولاية ساو باولو ، البرازيل.
<ol><li>تنمو نباتات البن في أواني بلاستيكية سعة 500 مل مملوءة بمحلول مغذيات Hoagland المائي (درجة الحموضة ~ 5.5) لمدة 4 أشهر في غرفة نمو محفوظة عند 27 ± 3 درجات مئوية مع فترة ضوئية مدتها 12 ساعة تم إنشاؤها بواسطة مصابيح LED عند تدفق الفوتون 250 ميكرومول s-1 m-2. استبدل محلول المغذيات Hoagland كل أسبوع لمدة 4 أشهر.</li>
	<li>تلقيح أربع أوراق موسعة من خمسة نباتات على أسطحها المحورية مع 1 × 103 H. vastatrix uredospores باتباع الطريقة الموضحة في المرجع28. بعد التلقيح ، احتفظ بالنباتات لمدة 48 ساعة في الظلام عن طريق تغطيتها بكيس بلاستيكي أسود. حصاد الآفات بعد 30 يوما من التلقيح.</li>
	<li>الآفات المميزة للحصاد التي تسببها سيركوسبورا كوفيكولا من كوفيا أرابيكا السيرة الذاتية. تقع نباتات أوباتا (الإحداثيات: -22.906506126269942, -47.015075902025266) في المعهد البيولوجي، كامبيناس، ولاية ساو باولو، البرازيل. قبل معالجة العينة ، قم بتحليل الآفات في المجهر المجسم للتحقق من وجود القهوة C. coffeicola conidia. ثم ، قم بتركيب بعض الشرائح باستخدام conidia لتأكيد مسببات المرض22.</li>
</ol>3. حصاد العينات وتثبيتها وجفافها
<ol><li>باستخدام مشرط وملقط ، قم بحصاد عينة من الأوراق ~ 10 مم2 في المنطقة الوسطى من الآفة (بقع صفراء; الشكل 1) واغمره في 30 مل من محلول كارنوفسكي المثبت (الشكل 1 والشكل 2A). يمكن أن تتم خطوة التثبيت في الثلاجة لمدة 48 ساعة.</li>
	<li>لمدة أربع مرات على الأقل ، أخضع عينة الورقة لفراغ منخفض (500-600 مللي بار) باستخدام مضخة زيت لمدة 15 دقيقة لكل منها لزيادة نفاذية المحلول المثبت في أنسجة الأوراق. نفذ هذه الخطوة مع تدوير العينة (الشكل 1).</li>
	<li>بعد التثبيت ، اغسل عينة الورقة ثلاث مرات في مخزن مؤقت كاكوديليت 0.5 M (الرقم الهيدروجيني 7.2) مخفف في الماء المقطر لمدة 5 دقائق لكل منها ثم انقلها إلى سلسلة إيثانولية متدرجة (30٪ ، 50٪ ، 70٪ ، 90٪ (2x) ، و 100٪ (2x)) لمدة 15 دقيقة عند كل تركيز إيثانول (الشكل 1 والشكل 2B).</li>
</ol>4. Historesin إجراء التضمين
<ol><li>انقل العينات تدريجيا إلى ميثاكريليت الجليكول (GMA) في ثلاث خطوات ، باتباع تعليمات الشركة المصنعة. أولا ، اصنع المحلول A عن طريق خلط مسحوق GMA (1 جم) مع 100 مل من الراتنج الأساسي (مجموعة historein ؛ جدول المواد) تحت التحريض المغناطيسي ، ثم اتبع الخطوات التالية.<ol>
<li>اغمر العينات في 1: 2 الحل A: 100٪ الإيثانول لمدة 3 ساعات.</li>
		<li>اغمر العينات في 1: 1 المحلول A: 100٪ الإيثانول لمدة 3 ساعات.</li>
		<li>اغمر العينات في راتنج أساسي نقي لمدة 2-4 أيام. خلال هذه الخطوة، قم بإخضاع العينات لفراغ منخفض أربع مرات على الأقل في اليوم لمدة 15 دقيقة متبوعة بالدوران.</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. البلمرة
ملاحظة: تتطلب عملية البلمرة قوالب بلاستيكية سعة 1.2 مل وراتنج أساسي ومصلب (انظر جدول المواد للحصول على تفاصيل المجموعة التجارية).
<ol><li>امزج 15 مل من المحلول A (الخطوة 4.1) مع 1 مل من المصلب في كوب مع الدوران لمدة دقيقتين لإنتاج محلول البلمرة (الحل B).</li>
	<li>ضع 1.2 مل من محلول البلمرة (المحلول B) في قوالب بلاستيكية. باستخدام معول خشبي ، انقل عينات الأوراق المصابة من الراتنج الأساسي النقي إلى المحلول B (الشكل 2C). تجنب استخدام الملقط لأنها يمكن أن تسبب سحق الأنسجة.</li>
	<li>تأكد من توجيه عينات الأوراق بسرعة عموديا على القوالب البلاستيكية حيث يصبح المحلول B لزجا بسرعة في غضون 5 دقائق. يمكن وضع أكثر من عينة واحدة من الأوراق المصابة في قالب واحد. ملاحظة: يوصى بممارسة الخطوة المذكورة أعلاه عدة مرات قبل التقدم بطلب للحصول على العديد من العينات. عندما يكون هناك العديد من العينات ، يختلف وقت البلمرة بين القوالب وقد يكون من الصعب تحقيق الاتجاه العمودي لعينات الأوراق.</li>
	<li>عندما يتم تحقيق الاتجاه العمودي لعينات الأوراق ، انتظر لمدة 30 دقيقة ، ثم انقل القالب البلاستيكي إلى غرفة بلاستيكية أو زجاجية تحتوي على هلام السيليكا لمنع الرطوبة. انتظر 2-3 ساعات للبلمرة.</li>
	<li>بمجرد بلمرة الراتنج وعينة الورقة بعد فترة 2-3 ساعات ، افصل الكتلة الناتجة عن القالب البلاستيكي عن طريق صنفرة قاعدة الكتلة بملف صنفرة. ثم ، قم بلصق الكتلة على قطعة من الخشب (الشكل 2D).</li>
</ol>6. التقسيم
<ol><li>باستخدام ميكروتوم دوار مجهز بشفرات فولاذية 8 سم (الشكل 2E) ، قم بقطع الكتلة إلى أقسام بسماكة 5 ميكرومتر. ضع الأقسام على شرائح زجاجية مغطاة بالماء المقطر. انقل الشرائح مع الأقسام العائمة فوق الماء إلى صفيحة ساخنة عند 40 درجة مئوية لتجف وتعزز التصاق الأقسام بالشرائح الزجاجية.</li>
	<li>بعد التجفيف (الشكل 2F) ، قم بتسمية الشرائح الزجاجية باسم مرجع الكتلة ورقم الشريحة.</li>
</ol>7. عملية تلطيخ مزدوجة
<ol><li>غطي الأقسام ب 2 مل من 5٪ قطن أزرق في لاكتوفينول (40٪ جليسرين ، 20٪ فينول ، و 20٪ حمض اللاكتيك في الماء) وقم بتسخينها على صفيحة ساخنة عند 45 درجة مئوية لمدة 5 دقائق (الشكل 3A).</li>
	<li>قم بإزالة الصبغة الزائدة عن طريق غسل الشريحة ثلاث مرات في كوب مملوء بالماء المقطر (الشكل 3B-D).</li>
	<li>وصمة عار مع 2 مل من 0.01 ٪ الروثينيوم الأحمر في الماء لمدة 1 دقيقة (الشكل 3E).</li>
	<li>قم بإزالة الصبغة الزائدة عن طريق غسل الشريحة ثلاث مرات في كوب مملوء بالماء المقطر (الشكل 3F ، G).</li>
	<li>ضع قطرة من الماء المقطر فوق الأقسام وقم بتغطية الأقسام بغطاء 24 مم × 60 مم لإجراء تحليل مجهري خفيف.</li>
</ol>

<ol><li>deBary, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Research+on+the+development+of+some+parasitic+fungi%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+Natural+Sciences.+Botany+and+Plant+Biology%22%5BJournal%5D)">Research on the development of some parasitic fungi.</a> Annals of Natural Sciences. Botany and Plant Biology. 20, 5(1863).</li>
<li>Mangin, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Research+on+the+Peronospores%5BTitle%5D)+AND+%22Bulletin+of+the+Natural+History+Society+of+Autun%22%5BJournal%5D)">Research on the Peronospores.</a> Bulletin of the Natural History Society of Autun. 8, 55-108 (1895).</li>
<li>Underwood, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+plant+cell+wall%3A+a+dynamic+barrier+against+pathogen+invasion%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Plant+Science%22%5BJournal%5D)">The plant cell wall: a dynamic barrier against pathogen invasion.</a> Frontiers in Plant Science. 3 (85), 1-6 (2012).</li>
<li>Hückelhoven, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+wall-associated+mechanisms+of+disease+resistance+and+susceptibility%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Phytopathology%22%5BJournal%5D)">Cell wall-associated mechanisms of disease resistance and susceptibility.</a> Annual Review of Phytopathology. 45, 101-127 (2007).</li>
<li>Voigt, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Callose-mediated+resistance+to+pathogenic+intruders+in+plant+defense-related+papillae%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Plant+Science%22%5BJournal%5D)">Callose-mediated resistance to pathogenic intruders in plant defense-related papillae.</a> Frontiers in Plant Science. 5 (168), 1-6 (2014).</li>
<li>Chowdhury, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+accumulation+of+callose%2C+arabinoxylan+and+cellulose+in+nonpenetrated+versus+penetrated+papillae+on+leaves+of+barley+infected+with+Blumeria+graminis+f.+sp.+Hordei%5BTitle%5D)+AND+%22New+Phytologist%22%5BJournal%5D)">Differential accumulation of callose, arabinoxylan and cellulose in nonpenetrated versus penetrated papillae on leaves of barley infected with Blumeria graminis f. sp. Hordei.</a> New Phytologist. 204 (3), 650-660 (2014).</li>
<li>Marques, J. P. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sugarcane+cell+wall-associated+defense+responses+to+infection+by+Sporisorium+scitamineum%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Plant+Science%22%5BJournal%5D)">Sugarcane cell wall-associated defense responses to infection by Sporisorium scitamineum.</a> Frontiers in Plant Science. 9 (698), 1-14 (2018).</li>
<li>Caffall, K. H., Mohnen, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+structure%2C+function%2C+and+biosynthesis+of+plant+cell+wall+pectic+polysaccharides%5BTitle%5D)+AND+%22Carbohydrate+Research%22%5BJournal%5D)">The structure, function, and biosynthesis of plant cell wall pectic polysaccharides.</a> Carbohydrate Research. 344, 1879-1900 (2009).</li>
<li>Carpita, N. C., Ralph, J., McCann, M. C. The cell wall. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aCarpita%2C+NC+%22Biochemistry+and+Molecular+Biology+of+Plants.%2C+2nd+Edition%22">Biochemistry and Molecular Biology of Plants., 2nd Edition</a>. , Wiley Blackwell. New York. 45(2015).</li>
<li>Lionetti, V., Cervone, F., Bellincampi, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methyl+esterification+of+pectin+plays+a+role+during+plant-pathogen+interactions+and+affects+plant+resistance+to+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Plant+Physiology%22%5BJournal%5D)">Methyl esterification of pectin plays a role during plant-pathogen interactions and affects plant resistance to diseases.</a> Journal of Plant Physiology. 169 (16), 1623-1630 (2012).</li>
<li>Lionetti, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pectoplate%3A+the+simultaneous+phenotyping+of+pectin+methylesterases%2C+pectinases%2C+and+oligogalacturonides+in+plants+during+biotic+stresses%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Plant+Science%22%5BJournal%5D)">Pectoplate: the simultaneous phenotyping of pectin methylesterases, pectinases, and oligogalacturonides in plants during biotic stresses.</a> Frontiers in Plant Science. 6 (331), 1-8 (2015).</li>
<li>Lionetti, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three+pectin+methylesterase+inhibitors+protect+cell+wall+integrity+for+Arabidopsis+immunity+to+Botrytis%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiology%22%5BJournal%5D)">Three pectin methylesterase inhibitors protect cell wall integrity for Arabidopsis immunity to Botrytis.</a> Plant Physiology. 173 (3), 1844-1863 (2017).</li>
<li>Heath, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Haustorium+sheath+formation+in+cowpea+leaves+immune+to+rust+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Phytopathology%22%5BJournal%5D)">Haustorium sheath formation in cowpea leaves immune to rust infection.</a> Phytopathology. 61, 383-388 (1971).</li>
<li>Silva, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coffee+resistance+to+the+main+diseases%3A+leaf+rust+and+coffee+berry+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Brazilian+Journal+of+Plant+Physiology%22%5BJournal%5D)">Coffee resistance to the main diseases: leaf rust and coffee berry disease.</a> Brazilian Journal of Plant Physiology. 18 (1), 119-147 (2006).</li>
<li>An, P., Li, X., Zheng, Y., Eneji, A. E., Inanaga, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+effects+on+root+cell+wall+composition+and+ion+contents+in+two+soybean+cultivars+under+salinity+stress%5BTitle%5D)+AND+%22Canadian+Journal+of+Plant+Science%22%5BJournal%5D)">Calcium effects on root cell wall composition and ion contents in two soybean cultivars under salinity stress.</a> Canadian Journal of Plant Science. 94 (4), 733-740 (2014).</li>
<li>Marques, J. P. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sugarcane+smut%3A+shedding+light+on+the+development+of+the+whip-shaped+sorus%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+Botany%22%5BJournal%5D)">Sugarcane smut: shedding light on the development of the whip-shaped sorus.</a> Annals of Botany. 119 (5), 815-827 (2017).</li>
<li>Delaye, L., García-Guzmán, G., Heil, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endophytes+versus+biotrophic+and+necrotrophic+pathogens-are+fungal+lifestyles+evolutionarily+stable+traits%5BTitle%5D)+AND+%22Fungal+Diversity%22%5BJournal%5D)">Endophytes versus biotrophic and necrotrophic pathogens-are fungal lifestyles evolutionarily stable traits.</a> Fungal Diversity. 60 (1), 125-135 (2013).</li>
<li>Avelino, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+coffee+rust+crises+in+Colombia+and+Central+America+%282008-2013%29%3A+impacts%2C+plausible+causes+and+proposed+solutions%5BTitle%5D)+AND+%22Food+Security%22%5BJournal%5D)">The coffee rust crises in Colombia and Central America (2008-2013): impacts, plausible causes and proposed solutions.</a> Food Security. 7, 303-321 (2015).</li>
<li>Zambolim, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Current+status+and+management+of+coffee+leaf+rust+in+Brazil%5BTitle%5D)+AND+%22Tropical+Plant+Pathology%22%5BJournal%5D)">Current status and management of coffee leaf rust in Brazil.</a> Tropical Plant Pathology. 41, 1-8 (2016).</li>
<li>Swiderska-Burek, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phytopathogenic+Cercosporoidfungi-from+taxonomy+to+modern+biochemistry+and+molecular+biology%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Molecular+Sciences%22%5BJournal%5D)">Phytopathogenic Cercosporoidfungi-from taxonomy to modern biochemistry and molecular biology.</a> International Journal of Molecular Sciences. 21 (22), 8555(2020).</li>
<li>Andrade, C. C. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Infection+process+and+defense+response+of+two+distinct+symptoms+of+Cercospora+leaf+spot+in+coffee+leaves%5BTitle%5D)+AND+%22Phytoparasitica%22%5BJournal%5D)">Infection process and defense response of two distinct symptoms of Cercospora leaf spot in coffee leaves.</a> Phytoparasitica. 49 (7), 727-737 (2021).</li>
<li>Zambolim, L. Coffee tree diseases. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aZambolim%2C+L+%22Handbook+of+Phytopathology%3A+Diseases+of+cultivated+plants.+5th+ed%22">Handbook of Phytopathology: Diseases of cultivated plants. 5th ed</a>. , Agronômica Ceres Santana (in Portuguese). São Paulo. 810(2016).</li>
<li>Castaño, A. J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coffee+rust%5BTitle%5D)+AND+%22Informative+report+Cenicaf%C3%A9%22%5BJournal%5D)">Coffee rust.</a> Informative report Cenicafé. 82, 313-327 (1956).</li>
<li>Echandi, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coffee+rust%2C+caused+by+the+fungus+Cercospora+coffeicola%5BTitle%5D)+AND+%22Turrialba%22%5BJournal%5D)">Coffee rust, caused by the fungus Cercospora coffeicola.</a> Turrialba. 9 (2), 54-67 (1959).</li>
<li>Souza, A. G. C., Rodrigues, F. A., Maffia, L. A., Mizubuti, E. S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Infection+process+of+Cercospora+coffeicola+on+coffee+leaf%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Phytopathology%22%5BJournal%5D)">Infection process of Cercospora coffeicola on coffee leaf.</a> Journal of Phytopathology. 159 (1), 6-11 (2011).</li>
<li>Karnovsky, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+formaldehyde-glutaraldehyde+fixative+of+high+osmolality+for+use+in+electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">A formaldehyde-glutaraldehyde fixative of high osmolality for use in electron microscopy.</a> Journal of Cell Biology. 27, 137-138 (1965).</li>
<li>Hoagland, D. R., Arnon, D. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+water-culture+method+for+growing+plants+without+soil%5BTitle%5D)+AND+%22College+of+Agriculture%2C+Agricultural+Experiment+Station%22%5BJournal%5D)">The water-culture method for growing plants without soil.</a> College of Agriculture, Agricultural Experiment Station. , University of California. Berkeley, California. 347(1950).</li>
<li>Eskes, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Resistance%5BTitle%5D)+AND+%22Coffee+rust%3A+epidemiology%2C+resistance+and+management%22%5BJournal%5D)">Resistance.</a> Coffee rust: epidemiology, resistance and management. 1, Boca Raton. 171(1989).</li>
<li>Silva, M. C., Nicole, M., Rijo, L., Geiger, J. P., Rodrigues, C. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytochemical+aspects+of+the+plant-rust+fungus+interface+during+the+compatible+interaction+Coffea+arabica+%28cv.+Caturra%29-Hemileia+vastatrix+%28race+III%29%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Plant+Sciences%22%5BJournal%5D)">Cytochemical aspects of the plant-rust fungus interface during the compatible interaction Coffea arabica (cv. Caturra)-Hemileia vastatrix (race III).</a> International Journal of Plant Sciences. 160 (1), 79-91 (1999).</li>
<li>Alves, R. F., Marques, J. P. R., Apezzato-da-Glória, B., Spósito, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Process+of+infection+and+colonization+of+Pseudocercospora+kaki+in+persimmon+leaves%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Phytopathology%22%5BJournal%5D)">Process of infection and colonization of Pseudocercospora kaki in persimmon leaves.</a> Journal of Phytopathology. 169 (3), 168-175 (2020).</li>
<li>Hayat, M. A. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aHayat%2C+MA+%22Principles+and+Techniques+of+Electron+Microscopy%3A+Biological+Applications%2C+Vol.+1%22">Principles and Techniques of Electron Microscopy: Biological Applications, Vol. 1</a>. , International Publishing. Berkeley Heights. 564(1981).</li>
<li>Paiva, E. A. S., Pinho, S. Z., Oliveira, D. M. T. Large plant samples: how to process for GMA embedding. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aPaiva%2C+EAS+%22Light+microscopy%3A+methods+and+protocols%22">Light microscopy: methods and protocols</a>. Chiarini-Garcia, H., Melo, R. C. N. 689, Humana Press. 37-49 (2011).</li>
<li>Marques, J. P. R., Soares, M. K. M., Appezzato-da-Glória, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+staining+technique+for+fungal-infected+plant+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Turkish+Journal+of+Botany%22%5BJournal%5D)">New staining technique for fungal-infected plant tissues.</a> Turkish Journal of Botany. 37 (4), 784-787 (2013).</li>
<li>Schuller, A., Ludwig-Müller, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histological+methods+to+detect+the+clubroot+pathogen+Plasmodiophora+brassicae+during+its+complex+life+cycle%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Pathology%22%5BJournal%5D)">Histological methods to detect the clubroot pathogen Plasmodiophora brassicae during its complex life cycle.</a> Plant Pathology. 65 (8), 1223-1237 (2016).</li>
<li>Braga, Z. V., Santos, R. F., Amorim, L., Appezzato-da-Glória, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histopathological+evidence+of+concomitant+sexual+and+asexual+reproduction+of+Elsino%C3%AB+ampelina+in+grapevine+under+subtropical+climate%5BTitle%5D)+AND+%22Physiological+and+Molecular+Plant+Pathology%22%5BJournal%5D)">Histopathological evidence of concomitant sexual and asexual reproduction of Elsinoë ampelina in grapevine under subtropical climate.</a> Physiological and Molecular Plant Pathology. 111, 101517(2020).</li>
<li>Marques, J. P. R., Soares, M. K. M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aMarques%2C+JPR+%22Manual+of+Techniques+Applied+to+Plant+Histopathology%22">Manual of Techniques Applied to Plant Histopathology</a>. Piracicaba, F. E. A. L. Q. , Santana. in Portuguese 140(2021).</li>
<li>Navarro, B. L., Marques, J. P. R., Appezzato-da-Glória, B., Spósito, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histopathology+of+Phakopsora+euvitis+on+Vitis+vinifera%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Plant+Pathology%22%5BJournal%5D)">Histopathology of Phakopsora euvitis on Vitis vinifera.</a> European Journal of Plant Pathology. 154, 1185-1193 (2019).</li>
<li>Chesters, C. G. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three+methods+of+using+cotton+blue+as+a+mycological+stain%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+Botany%22%5BJournal%5D)">Three methods of using cotton blue as a mycological stain.</a> Annals of Botany. 48 (3), 820-822 (1934).</li>
<li>Macedo, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Manual+of+Techniques+in+Plant+Histology%5BTitle%5D)+AND+%22Feira+de+Santana%3A+State+University+of+Feira+de+Santana%22%5BJournal%5D)">Manual of Techniques in Plant Histology.</a> Feira de Santana: State University of Feira de Santana. , in Portuguese 68(1997).</li>
<li>Lecker, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+lactophenol+cotton+blue+slide+mounts%5BTitle%5D)+AND+%22Community+Eye+Health+Journal%22%5BJournal%5D)">Preparation of lactophenol cotton blue slide mounts.</a> Community Eye Health Journal. 12 (30), 24(1999).</li>
<li>Whitakaer, F. C. S., Denison, F. C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lactic+acid+in+wool+dyeing%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+Society+of+Dyers+and+Colourists%22%5BJournal%5D)">Lactic acid in wool dyeing.</a> Journal of the Society of Dyers and Colourists. 98, 103(1895).</li>
<li>Chamberlain, C. J. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aChamberlain%2C+CJ+%22Methods+in+Plant+Histology%22">Methods in Plant Histology</a>. , The University of Chicago Press. Chicago. 349(1932).</li>
<li>Sterling, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crystal-structure+of+ruthenium+red+and+stereochemistry+of+its+pectin+stain%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Botany%22%5BJournal%5D)">Crystal-structure of ruthenium red and stereochemistry of its pectin stain.</a> American Journal of Botany. 57, 172-175 (1970).</li>
<li>Luft, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ruthenium+red+and+violet.+1.+Chemistry%2C+purification%2C+methods+of+use+for+electron+microscopy+and+mechanism+of+action%5BTitle%5D)+AND+%22The+Anatomical+Record%22%5BJournal%5D)">Ruthenium red and violet. 1. Chemistry, purification, methods of use for electron microscopy and mechanism of action.</a> The Anatomical Record. 171 (3), 347-368 (1971).</li>
<li>Buckeridge, M. S., Cavalari, A. A., Silva, G. B. D. A. Cell Wall. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBuckeridge%2C+MS+%22Plant+Physiology%22">Plant Physiology</a>. Kerbauy, G. B. , Guanabara Koogan. Rio de Janeiro. in Portuguese 165-181 (2013).</li>
</ol>

ويعلن صاحبا البلاغ عدم وجود تضارب في المصالح.

يقدم هذا العمل اختبارا نسيجيا كيميائيا بديلا مزدوج التلطيخ للتحقيق في تكوين البكتين لجدران الخلايا التي تغلف الهوستوريا في نظام مرضي حيوي. والهدف من ذلك أيضا هو إثبات فعالية الطريقة للكشف عن الفطريات الميتة وتغيرات جدار الخلية الناجمة عنها. هنا ، يمكن أن يغلف البكتين من جدران خلايا حمة القهوة كلا من الرقبة والهوستوريوم من فطر الصدأ Hemileia vastatrix. وصف سيلفا وآخرون أيضا التغليف بواسطة السليلوز والكالوز في نظام القهوة H. vastatrix المرضي14,29....

آليات الدفاع عن جدار الخلية في النباتات ضرورية لكبح العدوى الفطرية. وقد أبلغت الدراسات عن تغيرات في سمك جدار الخلية وتكوينها منذ القرن التاسععشر 1,2. يمكن أن تحدث هذه التغييرات بواسطة مسببات الأمراض الفطرية التي تحفز تكوين حليمة ، والتي تمنع الفطريات من دخول الخلية أو يمكن استخدامها لتغليف الواصلة لعزل بروتوبلاست الخلية المضيفة من الهوستوريا الفطرية. يعد إنتاج حاجز جدار خلية ديناميكي (أي الحليمات و haustorium مغلف بالكامل) مهما لتعزيز مقاومة النبات3. وقد بحثت الدراسات النسيجية المرضية على الأمراض المرتبطة بالفطريات في حدوث هذه الآليات ووصفت بوليمرات جدار الخلية والسليلوز والهيميسيلولوز (أرابينوكسيلان) والكالوز كآليات مقاومة للهجوم الفطري4،5،6،7.
جدار الخلية هو الحاجز الأول ضد هجوم الكائنات الحية الدقيقة ، مما يضعف التفاعل بين النبات والفطريات. تشكل السكريات البكتيكية جدار الخلية وتمثل حوالي 30٪ من تكوين جدار الخلية في الخلايا الأولية لنباتات اليوديكوت التي يكون فيها الهوموجالاكتورونان البوليمر الأكثر وفرة (حوالي 60٪)8. يفرز Golgi مركبات البكتين المعقدة التي تشكل سلاسل حمض الجالاكتورونيك ، والتي قد تكون أو لا تكون ميثيلية 8,9. منذ عام 2012 ، أشارت الأدبيات إلى أن درجة استرجاع ميثيل البكتين أمر بالغ الأهمية لتحديد التوافق أثناء العدوى بالإنزيمات البكتية الميكروبية 10،11،12. وبالتالي ، هناك حاجة إلى بروتوكولات للتحقق من وجود وتوزيع المركبات البكتيكية في النظم المرضية النباتية الفطرية.
تم استخدام تقنيات مختلفة للكشف عن تغليف الحليمات أو haustoria. الطرق المرجعية المستخدمة هي المجهر الإلكتروني الناقل (TEM) للأنسجة الثابتة والمجهر الضوئي للأنسجة الحية والثابتة. فيما يتعلق ب TEM ، أظهرت العديد من الدراسات الدور الهيكلي لتعيينات جدار الخلية في المقاومة الفطرية 13،14،15،16 ، وأن استخدام الليكتين والأجسام المضادة هو طريقة معقدة لتحديد موقع بوليمرات الكربوهيدرات 16. ومع ذلك ، تشير الدراسات إلى أن الفحص المجهري الضوئي هو نهج مهم وأن الأدوات الكيميائية النسيجية والكيميائية المناعية تسمح بفهم أفضل لتكوين الحليمات وتغليف الهوستوريوم 6,7.
تظهر الفطريات المسببة للأمراض نوعين رئيسيين من أنماط الحياة: التغذية الحيوية والميتة. تعتمد الفطريات الحيوية على الخلايا الحية لتغذيتها في حين أن الفطريات الميتة تقتل الخلايا المضيفة ، ثم تعيش في الأنسجة الميتة17. في أمريكا اللاتينية ، صدأ أوراق البن ، الناجم عن الفطريات Hemileia vastatrix ، هو مرض مهم في محاصيل البن18,19. يقدم Hemileia vastatrix سلوكا حيويا ، ومن بين التغيرات الهيكلية التي لوحظت في أنواع أو أصناف القهوة المقاومة ، تم الإبلاغ عن استجابة فرط الحساسية ، وترسب الكالوز والسليلوز واللجنين على جدران الخلايا ، وكذلك تضخم الخلايا14. على حد علم المؤلفين ، لا تقدم الأدبيات معلومات حول أهمية البكتين في مقاومة صدأ القهوة. من ناحية أخرى ، تستهدف الفطريات الميتة التي تسبب التهاب عنق الرحم البكتين عبر مجموعة من الإنزيمات المرتبطة بتدهور جدار الخلية ، مثل البكتيناز و polygalacturonase20. Cercosporiosis في البن ، الناجم عن الفطريات Cercospora coffeicola هو أيضا تهديد كبير لمحاصيل البن21,22. هذا الفطر يسبب آفات نخرية في كل من الأوراق والتوت. بعد الاختراق ، يستعمر C. coffeicola الأنسجة النباتية من خلال المسارات داخل الخلايا وبين الخلايا 23،24،25.
يبحث هذا البروتوكول في وجود هياكل فطرية وبكتين على جدران الخلايا. هذا البروتوكول مفيد لتحديد استجابة النبات المرتبطة بالبكتين (ملطخة بصبغة الروثينيوم الحمراء ، والتي هي خاصة بالمجموعات الحمضية من الأحماض البولي يورونيك من البكتين) ، التي يسببها المضيف في تفاعل حيوي مع الفطريات. كما أنه يساعد على التحقق من تأثير الفطريات الميتة على تدهور جدران الخلايا البكتيكية. تشير النتائج الحالية إلى أن طريقة التلطيخ المزدوج فعالة في التمييز بين الهياكل والمرحلة التناسلية للفطريات.

<table><tbody><tr><td>شفرات DB80 HS</td><td>Leica</td><td>14035838383</td><td>تقسيم</td></tr><tr><td>عازلة Cacodylate</td><td>EMS</td> <td># 11652</td><td>تثبيت</td></tr><tr><td>قطن أزرق لاكتوفينول</td><td>Metaqu &iacute ؛ الميكا</td><td>70SOLSIG024629</td><td>تلطيخ</td></tr><tr><td>الفورمالديهايد</td><td>EMS</td> <td># 15712</td><td>تثبيت</td></tr><tr><td>الجلوتارالديهايد</td><td>EMS</td> <td># 16216</td><td>تثبيت</td></tr><tr><td>Historesin Kit</td><td>Technovit / EMS</td> <td># 14653</td><td>Historesin لتضمين</td></tr><tr><td>لوحة ساخنة</td><td>Dubesser</td><td>SSCD25X30-110V</td><td>تلطيخ</td></tr><tr><td>المجهر</td><td>Zeiss</td> <td># 490040-0030-000</td><td>التقاط الصور</td></tr><tr><td>Microtome (Leica RM 2540)</td><td>Leica</td><td>149BIO000C1 14050238005</td><td>تقطيع</td></tr><tr><td>علبة أكواب صب البلاستيك</td><td>EMS</td><td>10176-30</td><td>تلطيخ</td></tr><tr><td>الروثينيوم الأحمر</td><td>LABHouse</td> <td># 006004</td><td>تلطيخ</td></tr><tr><td>برنامج Axion Vision</td><td>Zeiss</td> <td># 410130-0909-000</td><td>التقاط صورة</td></tr><tr><td>مضخة فراغ</td><td>Prismatec</td><td>131 TIPO 2 V.C.</td><td>تثبيت</td></tr></tbody></table>

طريقة تلطيخ مزدوج للكشف عن البكتين في التفاعل بين النبات والفطريات

Double-Staining Method to Detect Pectin in Plant-Fungus Interaction

تستخدم الخلايا النباتية آليات هيكلية مختلفة ، إما تأسيسية أو مستحثة ، للدفاع عن نفسها من العدوى الفطرية. التغليف هو آلية فعالة للحث على عزل الهوستوريا الفطرية من بروتوبلاست الخلية النباتية. على العكس من ذلك ، فإن البكتين ، أحد المكونات البوليمرية لجدار الخلية ، هو هدف للعديد من الإنزيمات المحللة للبكتالوتيك في التفاعلات الضمورية. هنا ، يتم تقديم بروتوكول للكشف عن البكتين والفطريات من خلال المجهر الضوئي. يتم التحقيق في التغليف الغني بالبكتين في خلايا أوراق القهوة المصابة بفطر الصدأ Hemileia vastatrix وتعديل جدار خلية mesophyll الناجم عن Cercospora coffeicola . تم إصلاح عينات الأوراق المصابة بمحلول كارنوفسكي ، وتجفيفها ، وتضمينها في ميثاكريليت الجليكول لمدة 2-4 أيام. اتبعت جميع الخطوات عن طريق الضخ الفراغي لإزالة الهواء في المساحات بين الخلايا وتحسين عملية التضمين. تم تقسيم الكتل المدمجة إلى أقسام بسماكة 5-7 ميكرومتر ، والتي تم ترسيبها على شريحة زجاجية مغطاة بالماء وتم تسخينها لاحقا عند 40 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة. بعد ذلك ، كانت الشرائح ملطخة مرتين ب 5٪ قطن أزرق في لاكتوفينول للكشف عن الفطريات و 0.05٪ من الروثينيوم الأحمر في الماء للكشف عن البكتين (المجموعات الحمضية من الأحماض البولي يورونيك من البكتين). تم العثور على الهوستوريا الفطرية من Hemileia vastatrix مغلفة بالبكتين. في cercosporiosis القهوة ، أظهرت خلايا mesophyll ذوبان جدران الخلايا ، ولوحظ hyphae بين الخلايا و conidiophoress. الطريقة المعروضة هنا فعالة للكشف عن الاستجابة المرتبطة بالبكتين في التفاعل بين النبات والفطريات.

كشف تلطيخ لاكتوفينول أزرق قطني على القسم المدمج في GMA عن وجود العديد من الهياكل الفطرية بين وداخل خلايا ميزوفيل القهوة في كل من التفاعلات الفطرية الحيوية والميتة.
في النظام المرضي الحيوي ، عند تلطيخه باستخدام طريقة التلطيخ المزدوج ، تظهر Hyphae Hemileia vastatrix التي تحتوي على جدران الخلايا ومحتوى البروتوبلاستيدات الكثيف باللون الأزرق الداكن في كل من الحمة الإسفنجية و palisade (الشكل 4A ، B). تظهر الخلية الأم الهوستوريوم (Hmc) والهوستور...

يصف هذا البروتوكول طريقة مجهرية للكشف عن البكتين في التفاعل بين القهوة والفطريات.

Plant cells use different structural mechanisms, either constitutive or inducible, to defend themselves from fungal infection. Encapsulation is an ...

هذا البروتوكول مهم لأنه يجعل من الممكن تحديد التفاعل بين النبات والفطريات. بالإضافة إلى تلوين البكتين ، فإنه يوضح أيضا عيوبا في بوليمر جدار الخلية الممرض ويسمح بتحديد هياكل الفطريات. يمكن إجراء هذه التقنية البسيطة وغير المعقدة باستخدام المجهر الضوئي ولا تتطلب أي معدات باهظة الثمن مثل المجهر الإلكتروني الماسح.بالإضافة إلى ذلك ، إنها تقنية سريعة تحصل على تمييز ممتاز للهياكل النباتية للدراسات النسيجية. تحدد هذه التقنية التفاعل بين النبات والفطريات. وبالتالي ، فإنه يتعاون لتشخيص الأمراض التي تسببها الفطريات الحيوية والميتة مثل صدأ القهوة و cercosporiosis.للبدء ، قم بالحصاد وعينة أوراق 10 ملليمتر مربع تقريبا في المنطقة الوسطى من الآفة باستخدام مشرط وملقط ، واغمرها في 30 ملليلتر من محلول كارنوفسكي المثبت. قم بإخضاع عينة الورقة لفراغ منخفض من 500 إلى 600 ملليبار لمدة 15 دقيقة باستخدام مضخة زيت ، أربع مرات على الأقل لزيادة نفاذية المحلول المثبت في أنسجة الورقة. بعد التثبيت ، اغسل عينة الورقة ثلاث مرات في مخزن مؤقت 0.5 M cacodylate مخفف في الماء المقطر لمدة خمس دقائق لكل منها ، ثم انقلها إلى سلسلة إيثانوليك متدرجة لمدة 15 دقيقة عند كل تركيز إيثانول.لنقل العينات تدريجيا إلى ميثاكريلات الجليكول ، اصنع المحلول A عن طريق خلط غرام واحد من مسحوق ميثاكريليت الجليكول مع 100 ملليلتر من الراتنج الأساسي تحت التحريض المغناطيسي. ثم ، اغمر العينات بنسبة واحد إلى اثنين من المحلول A و 100٪ من الإيثانول لمدة ثلاث ساعات. اغمر العينات بنسبة واحد إلى واحد للمحلول A: 100٪ إيثانول لمدة ثلاث ساعات ، ثم غمرها في راتنج أساسي نقي لمدة يومين إلى أربعة أيام.أخضع العينة لفراغ منخفض أربع مرات على الأقل في اليوم لمدة 15 دقيقة، يليها الدوران. امزج 15 ملليلتر من المحلول A مع ملليلتر واحد من المصلب في كوب مع الدوران لمدة دقيقتين لإنتاج محلول البلمرة B.ضع 1.2 ملليلتر من محلول البلمرة B هذا في قوالب بلاستيكية. باستخدام معول خشبي ، انقل عينات الأوراق المصابة من الراتنج الأساسي النقي إلى المحلول B وتجنب استخدام الملقط لأنها يمكن أن تسبب سحق الأنسجة.تأكد من توجيه عينات الأوراق بسرعة عموديا على القوالب البلاستيكية حيث يصبح الحل B لزجا بسرعة. عندما يتم تحقيق الاتجاه العمودي لعينات الأوراق ، انتظر لمدة 30 دقيقة ثم انقل القالب البلاستيكي إلى غرفة بلاستيكية أو زجاجية تحتوي على هلام السيليكا لمنع الرطوبة. بمجرد بلمرة الراتنج وعينة الورقة بعد ساعتين إلى ثلاث ساعات ، افصل الكتلة الناتجة عن القالب البلاستيكي عن طريق صنفرة قاعدة الكتلة بملف صنفرة.ثم ، قم بلصق الكتلة على قطعة من الخشب. قطع الكتلة إلى أقسام سميكة خمسة ميكرومتر باستخدام ميكروتوم دوار مجهز بشفرات فولاذية ثمانية سنتيمترات. ضع الأقسام على شرائح زجاجية مغطاة بالماء المقطر.ثم ، انقل الشرائح إلى صفيحة ساخنة لتجف عند 40 درجة مئوية وعزز التصاق الأقسام بالشرائح الزجاجية. بعد التجفيف، قم بتسمية الشرائح الزجاجية باسم مرجع الكتلة ورقم الشريحة. غطي الأقسام بملليلتر من القطن الأزرق بنسبة 5٪ في لاكتوفينول وقم بتسخينها على صفيحة ساخنة عند 45 درجة مئوية لمدة خمس دقائق.قم بإزالة الصبغة الزائدة عن طريق غسل الشريحة ثلاث مرات في كوب مملوء بالماء المقطر. قم بتلطيخ الماء بملليلتر من 0.01٪ من الروثينيوم الأحمر في الماء لمدة دقيقة واحدة. قم بإزالة الصبغة الزائدة عن طريق غسل الشريحة ثلاث مرات في كوب مملوء بالماء المقطر.ضع قطرة من الماء المقطر فوق الأقسام وقم بتغطية الأقسام بقسيمة غطاء لإجراء تحليل مجهري خفيف. في طريقة التلطيخ المزدوج ، ظهرت Hyphae Hemileia vastatrix التي تحتوي على جدران الخلايا ومحتوى البروتوبلاست الكثيف باللون الأزرق الداكن في كل من الحمة الإسفنجية و palisade. كما أظهرت الخلية الأم الهوستوريوم والهوستوريا لونا أزرق داكنا.تلطيخ العداد مع الروثينيوم الأحمر توزيع فطري محدد بوضوح في المساحات بين الخلايا. أثناء التفاعل ، كسرت الخلية الأم Hemileia vastatrix haustorium جدار الخلية المضيفة وطورت رقبة هاوستوريال محاطة بمركبات بكتيكية. لا يمكن للتغليف الوردي والأحمر الغني بالبكتين للرقبة الهاوستوريالية أن يمنع التكوين الهاوستوري.في بعض الحالات ، قام التغليف الغني بالبكتين بتغليف الهاوستوريوم بشكل غير كامل. وفي بعض الحالات ، يتم تغليف الهاوستوريوم بالكامل. يحافظ جدار الخلية الغني بالبكتين على السلامة عند حدود الآفة ، حيث لا توجد الفطريات.أظهرت طريقة التلطيخ المزدوج وجود hyphae بين الخلايا. في مناطق التفاعل ، يبدو أن جدران خلايا البكتين تفقد سلامتها بسبب الذوبان. تم العثور على الهياكل التناسلية مثل conidia في البشرة المحورية.تم العثور على سيركوسبورا كوفيكولا Hyphae في الغرفة تحت الجلد كهياكل تجعيد الشعر ، ويبدو أن حمة الباليسيد في منطقة الآفة تخضع لتحلل جدار الخلية. تجنب استخدام الملقط لأنها يمكن أن تسبب سحق الأنسجة. وينبغي إجراء المزيد من الدراسات النسيجية المرضية على الصدأ والجمرة الخبيثة وداء السيركوسبوريوسيس والتفحم وغيرها من التفاعلات بين النباتات والفطريات النباتية والميتة والمستحثة بيولوجيا للتحقيق في الاستخدام المحتمل لهذه التقنية في النظم المرضية المختلفة.

double-staining-method-to-detect-pectin-in-plant-fungus-interaction

Research

JoVE Journal

Biology

علم الأحياء

يوضح هذا الفيديو طريقة تلطيخ مزدوجة باستخدام أحمر الروثينيوم والأزرق القطني اللاكتوفينول لتصور البكتين والكيتين أثناء تفاعلات الفطريات النباتية في نبات صدأ القهوة. يساعد الإجراء في فهم آليات الدفاع عن النبات أثناء الالتهابات الفطرية.

طريقة التلوين المزدوج: تقنية لتصور تفاعلات الفطريات النباتية باستخدام أحمر الروثينيوم والأزرق القطني اللاكتوفينول

يصف هذا الفيديو طريقة لنمو الأغشية الحيوية البكتيرية وتحليلها نوعيا على الخيوط الفطرية باستخدام الفحص المجهري. تتشكل الأغشية الحيوية البكتيرية بشكل متكرر على الأسطح الفطرية وتتضمن العديد من عمليات التفاعل البكتيري والفطري ، مثل التعاون الأيضي أو المنافسة أو الافتراس.

طريقة لتحضير العينة لتصور البكتيريا المكونة للأغشية الحيوية على الخيوط الفطرية

يوضح هذا الفيديو تقنية تلطيخ مناعي لتوطين بروتينات أرابينوجالاكتان (AGPs) والبكتين في الأنسجة النباتية. يتم تلطيخ أقسام الأنسجة النباتية الثابتة والمضمنة بالراتنج بالأجسام المضادة الأولية والفلورية الخاصة ب AGP والبكتين وصبغة فلورية مرتبطة بالسليلوز للكشف عن توضعها الخاص بالأنسجة في جدار الخلية.

توطين مناعي لبروتينات أرابينوجالاكتان والبكتين في الأنسجة النباتية

يختلف تكوين جدار الخلية النباتية بين أنواع الأنسجة ويمكن أن يشمل اللجنين والسليلوز والهيميسليلوز والبكتين. تم تطوير تقنيات تلوين مختلفة لتصور الاختلافات على مستوى نوع الخلية. هذه الورقة عبارة عن مجموعة من تقنيات تلطيخ جدار الخلية شائعة الاستخدام.

تلطيخ النسيجية من<em&gt; نبات الأرابيدوبسيس thaliana</em&gt; الخليوي الثانوية ستريت عناصر

الاصباغ الفلورية الحيوية هي أدوات أساسيه لتحليلات التصوير بالخلايا الحية في بيولوجيا الخلايا الفطرية الحديثة. هذه الورقة تفاصيل تطبيق الاصباغ الفلورية الثابتة والمعروفة لتتبع ديناميات غشاء البلازما ، اندو-/الندرات والخلايا الجدارية تخلق في الفطريات الخيطية.

تطبيق غشاء وجدار الخلية الاصباغ الفلورية الانتقائية لتصوير الخلايا الحية من الفطريات الخيطية

يصف هذا البروتوكول بالتفصيل كيفية إصلاح المواد النباتية لإضفاء الطابع المناعي على البروتينات والبكتين العربي ، وجزءًا من راتنج الأكريليك المائي ، المقطع والمثبت على الشرائح الزجاجية. نظهر سيتم الكشف عن epitopes جدار الخلية ذات الصلة مع الأجسام المضادة محددة.

الفلورسنت المناعية من البروتينات و البكتينات أرابينغالات في جدار الخلية من الأنسجة النباتية

يصف البروتوكول هنا طرق تقييم أنماط الاستعمار الفطري المفصلي والاستراتيجية في الجذور لنوعين: Zea mays و Festuca rubra. يسمح استخدام طريقة MycoPatt بحساب المعلمات ، وتحويل الهياكل الفطرية إلى بيانات رقمية ، ورسم خرائط لموقعها الحقيقي في الجذور.

خرائط Mycorrhizal كأداة لاستكشاف أنماط الاستعمار والاستراتيجيات الفطرية في جذور Festuca rubra و Zea mays

يهدف هذا البروتوكول إلى توفير إجراءات مفصلة لجمع وتثبيت وصيانة عينات النباتات المتغايرة ، وتطبيق تقنيات الفحص المجهري المختلفة مثل المسح المجهري الإلكتروني ونقله ، والمجهر الضوئي ، والكونفوكال ، والمجهر الفلوري لدراسة الاستعمار الفطري في الأنسجة النباتية والبذور المنبتة بالفطريات الفطرية.

تقنيات الفحص المجهري لتفسير الاستعمار الفطري في أنسجة النباتات المتغايرة والإنبات التكافلي للبذور

نظرا لعتامة التربة ، لا يمكن بسهولة تصور التفاعلات بين الميكروبات المكونة لها بدقة خلوية. هنا ، يتم تقديم أداتين للسوائل الدقيقة ، والتي توفر فرصا جديدة للتحقيق في التفاعلات الفطرية الميكروبية. الأجهزة متعددة الاستخدامات وسهلة الاستخدام ، مما يتيح التحكم الزماني المكاني العالي والتصوير عالي الدقة على المستوى الخلوي.

أدوات الموائع الدقيقة للتحقيق في التفاعلات الفطرية الميكروبية على المستوى الخلوي

تهدف المقالة الحالية إلى توفير بروتوكولات مفصلة وكافية لعزل الفطريات الداخلية المرتبطة بالنباتات ، والحفاظ على العزلات على المدى الطويل ، والتوصيف المورفولوجي ، واستخراج الحمض النووي الكلي لتحديد الجزيئات اللاحقة والتحليلات الميتاجينومية.

عزل وتوصيف واستخلاص الحمض النووي الكلي لتحديد الفطريات الداخلية في النباتات الفطرية ذاتية التغذية

يصف هذا التقرير الطرق الأساسية المستخدمة لزراعة الطحالب العقدية أحادية الخلية والتلاعب بها تجريبيا. كما يوفر بروتوكولات أساسية للتصوير القائم على الفحص المجهري ، بما في ذلك وضع العلامات على الخلايا الحية بالأجسام المضادة وحيدة النسيلة ومجسات الفلورسنت الأخرى والفحص المجهري الإلكتروني الماسح.

بروتوكولات الفحص التجريبية والكيمياء المناعية وتقنيات التصوير القائمة على الفحص المجهري للبنيوم مارغريتاسيوم

اكتشف طريقة التلطيخ المزدوج للكشف عن البكتين في تفاعلات النبات والفطريات باستخدام المجهر الضوئي. تُمكّن هذه التقنية من تحديد هياكل الفطريات وعيوب جدار الخلية بدون معدات مكلفة.

طريقة تلطيخ مزدوج للكشف عن البكتين في التفاعل بين النبات والفطريات

استكشف المزيد من الفيديوهات