الكي الكامل الدائرة للضفيرة الوعائية الداكنة حول القزحية للزرق المستحث جراحيا في القوارض

الهدف من هذا البروتوكول هو توصيف نموذج جديد للتنكس العصبي الزرق على أساس الكي الحراري 360 درجة للضفيرة الوعائية الحوفية ، مما يؤدي إلى ارتفاع ضغط الدم العيني تحت الحاد.

لقد طورنا طريقة بسيطة للحث على تنكس الجلوكوما القوي والتدريجي بناء على الارتفاع المؤقت لضغط العين. وهذا يمثل فرصة فريدة لدراسة النقاط الرئيسية للفيزيولوجيا المرضية للجلوكوما. هذا نموذج سهل التعلم وغير جراحي ومنخفض التكلفة وقابل للتكرار بدرجة كبيرة يتيح تحليل الوظائف في الجسم الحي والتصاميم التجريبية قصيرة المدى باستخدام عدد أقل من الحيوانات لكل تجربة.

تعتبر شبكية العين والعصب البصري جزأين يمكن تقييمهما من الجهاز العصبي المركزي ، لذا فإن نمذجة الضعف التدريجي لهذه الهياكل يمكن أن توفر رؤى قيمة حول الاضطرابات التنكسية العصبية الأخرى. لقياس ضغط العين الأساسي ، أو IOP ، لكل من عيون التحكم التجريبية والمقابلة ، ضع الجرذ المخدر في وضع الاستلقاء البطني على سطح المقعد ، بحيث يمكن الوصول بسهولة إلى سطح القرنية إلى طرف مقياس التوتر. ضع طرف مقياس التوتر بحيث يلامس قليلا منطقة القرنية المركزية بشكل عمودي.

ثم ، احصل على القياس بالضغط على زر القياس. بعد ذلك ، ضع الجرذ في وضع استلقاء جانبي طفيف تحت مجهر ستيريو وافحص العين التجريبية بتكبير 40 مرة. أثناء الإجراء ، حافظ على تشحيم عين التحكم المقابلة عن طريق غرس قطرة من كارميلوز الصوديوم أو هيالورونات الصوديوم.

بعد ذلك ، باستخدام ملقط منحني ، ادفع مقلة العين التجريبية برفق للأمام لكشف الأوعية الدموية المحيطة بزاوية 360 درجة من الطرف. ثم ، من ناحية أخرى ، باستخدام الكي العيني منخفض الحرارة ، قم بكي الأوعية برفق في جميع أنحاء القرنية. احرص على عدم كي محيط القرنية.

تأكيد نجاح العملية الجراحية من خلال ملاحظة ظهور علامات دائرية صغيرة من الكي على الحافة الصلبة ، وطمس الأوعية الدموية الطرفية ، واتساع حدقة العين في العين التي تم تشغيلها. بعد الجراحة ، تحقق من IOP بعد الجراحة مباشرة في كلتا العينين كما هو موضح سابقا. ثم ، ضع قطرة من أسيتات بريدنيزولون العينية على السطح الأمامي للعين التجريبية.

بعد 40 ثانية ، استبدله بمرهم مضاد حيوي للعيون. تطبيق متابعة سريرية يومية للعين التجريبية مع الأدوية الموضعية التي تتكون من المخدرات المضادة للالتهابات غير الستيرويدية ومرهم المضادات الحيوية. لتحليل الاستجابة الحركية البصرية ، ضع الجرذ للتعود على منصة مبنية بأربع شاشات كمبيوتر في رباعي الزوايا.

حافظ على مؤشر الشعر المتقاطع الأحمر على إطار الفيديو بين عيني الجرذ الذي يتحرك بحرية ، لأنه يشير إلى مركز الأسطوانة الافتراضية. لاحظ الاستجابة الحركية البصرية التي تتكون من تتبع انعكاسي لرأس الجرذ ورقبته التي تثيرها الدرجات الدوارة. في البداية ، أدخل حافزا بتردد مكاني منخفض ، ثم قم بزيادة التردد تدريجيا حتى لا يتم ملاحظة حركة التتبع.

لتسجيل نمط مخطط كهربية الشبكية ، بعد تخدير الفئران ، أدخل بعناية القطب النشط في المحيط الزمني للقرنية. بالإضافة إلى ذلك ، أدخل القطب المرجعي في النسيج تحت الجلد للكانثوس الصدغي المماثل والقطب الأرضي في أحد الأطراف الخلفية. ثم ضع الجرذ على بعد 20 سم من شاشة التحفيز ، وراقب خط الأساس للإشارة ، وابدأ عملية الاستحواذ بالضغط على زر التحليل في نظام الاستحواذ.

بعد عزل شبكية العين ، قم بنقلها إلى لوحة مزرعة مكونة من 24 بئرا تحتوي على ملليلتر واحد من PBS ، مع إبقاء شبكية العين الداخلية متجهة لأعلى. تتخلل الأنسجة عن طريق الغسيل مع السطحي غير الأيونية 0.5 ٪ المخففة في برنامج تلفزيوني. ثم ، احتضان الأنسجة وحجب الحل لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة مع هز لطيف.

أثناء الحضانة ، قم بإعداد محلول الأجسام المضادة الأولية Brn-3a وتخزينه عند أربع درجات مئوية. بعد انسداد الأنسجة ، احتضان شبكية العين في 200 ميكرولتر من محلول الأجسام المضادة الأولية عند أربع درجات مئوية لمدة 72 ساعة مع هز لطيف. بعد ذلك ، اغسل الأنسجة باستخدام برنامج تلفزيوني.

احتضان الأنسجة في 200 ميكرولتر من محلول الأجسام المضادة الثانوي لمدة ساعتين في درجة حرارة الغرفة ثم بمحلول البقع المضادة النووية لمدة 10 دقائق لتلطيخ نوى الفلورسنت. بعد ثلاث غسلات PBS ، انقل شبكية العين إلى شريحة مجهر زجاجية باستخدام فرشتين صغيرتين تحافظان على الجانب الزجاجي لأعلى. ضع ربع الشبكية الظهري لأعلى على شريحة المجهر.

أخيرا ، ضع 200 ميكرولتر من وسط التثبيت المضاد للتلاشي على زلة غطاء زجاجي وضعه على شبكية العين المثبتة بشكل مسطح للتحليل المجهري. تحت مجهر التألق متحد البؤر ، باستخدام هدف مكبرة 40 مرة ، افحص الحوامل المسطحة لتقدير خلايا العقدة الشبكية. بعد استئصال مقلة العين ، قم بإزالة الجزء القريب من الجزء داخل الحجاج من العصب البصري ، بما في ذلك جزء من الجزء داخل العين.

ثم ، ضع العينات على الفور في قوارير أو أنابيب تحتوي على 200 إلى 300 ميكرولتر من المثبت البارد. بعد ساعتين ، اغسل المنديل باستخدام محلول كاكوديلات الصوديوم البارد 100 ميكرومول. بعد ذلك ، قم بتثبيت الأنسجة لمدة ساعة واحدة في رابع أكسيد الأوزميوم 1٪ وخمسة كلوريد الكالسيوم النانوي عند أربع درجات مئوية تحت رج لطيف.

بعد ثلاث غسلات مع المخزن المؤقت كاكوديلات الصوديوم البارد ، اغسل شظايا العصب البصري بالماء المقطر البارد قبل الحضانة طوال الليل وخلات المبولة 1٪ عند أربع درجات مئوية. في اليوم التالي ، بعد ثلاث غسلات بالماء ، قم بتجفيف الأنسجة تدريجيا بزيادة تركيزات الأسيتون. بعد ذلك ، قم بإجراء ثلاث جولات من التضمين ومحاليل الأسيتون راتنجات الايبوكسي قبل تضمين الأنسجة في راتنجات الايبوكسي النقية لمدة 24 ساعة.

في اليوم التالي ، قم بإزالة العينات من حامل العينات ونقلها إلى قوالب التضمين لمدة 48 ساعة عند 60 درجة مئوية. بعد البلمرة ، استخدم ميكروتوم فائق لقطع الأجزاء شبه الرقيقة المستعرضة من شظايا العصب البصري. بعد ذلك ، قم بجمع ونقل الأقسام إلى شريحة زجاجية مجهرية.

قم بتلطيخ المقاطع باللون الأزرق التولويدين وصورها باستخدام مجهر بصري بتكبير 100 مرة. للتحليل الهيكلي الفائق ، قم بإجراء مقاطع عرضية رفيعة للغاية واجمعها على شبكة نحاسية. بعد ذلك ، قم بتلطيخ الأقسام بأسيتات المبولة وسترات الرصاص للفحص المجهري الإلكتروني النافذ.

أدى الكي الكامل الدائرة إلى ارتفاع IOP مباشرة بعد الجراحة مقارنة بالعيون الضابطة. لوحظت ذروة IOP بعد الجراحة في اليوم الأول وانخفضت تدريجيا إلى مستويات خط الأساس في اليوم السادس. علاوة على ذلك ، تم تقييم وظيفة الشبكية سلوكيا وفيزيولوجيا كهربية باستخدام منعكس حركي بصري ومخطط كهربية الشبكية ، على التوالي.

بعد الجراحة ، أظهرت كلتا المعلمتين مرحلتين متميزتين من الضعف: المرحلة الحادة لارتفاع ضغط الدم في العين في اليوم الثالث ومرحلة التنكس الثانوي في اليوم 30. بالمقارنة مع الأعصاب البصرية الضابطة ، انخفض عدد المحاور العصبية وأقسام العصب البصري المستعرضة شبه الرقيقة تدريجيا بعد الجراحة. أظهرت الصور المجهرية الإلكترونية للأعصاب البصرية من العين الضابطة أليافا ميالينية مكتظة بكثافة مفصولة بعمليات الخلايا الدبقية الرقيقة والأنابيب الدقيقة المحورية الواضحة والخيوط العصبية.

في المقابل ، بعد ثلاثة أيام من ارتفاع ضغط الدم في العين ، لوحظ عدد قليل من الألياف المتدهورة ، والفراغ السيتوبلازمي في عمليات الخلايا الدبقية ، والكروماتين المكثف في نوى الخلايا الدبقية. بعد سبعة أيام ، كانت هناك زيادة في الألياف المحورية المتدهورة وعمليات الخلايا الدبقية مفرطة التوتر. وبعد 14 يوما ، لوحظ المزيد من الفوضى في الألياف العصبية البصرية المرتبطة بغزو عمليات الخلايا الدبقية بين المحاور.

علاوة على ذلك ، انخفضت كثافة خلايا العقدة الشبكية مع مرور الوقت بشكل رئيسي في أرباع الشبكية الظهرية والزمانية. أثناء تنفيذ هذا الإجراء ، حاول لمس الأوعية الداكنة حول القزحية برفق بطرف الكي ، مع تجنيب محيط الحبل السري والتأكد من ملاحظة علامات الكي المستمرة في جميع أنحاء الحافة الصلبة. بعد هذا الإجراء ، يمكن تطبيق مجموعة متنوعة من الطرق ، مثل التقييم الكيميائي الحيوي الوظيفي والكيميائي المناعي لهياكل العين والطرق الأخرى التي قد تعترف بأمراض فسيولوجيا الجلوكوما.