بصريات غير خطية خالية من الملصقات لدراسة العيوب المعتمدة على التوبولين في المايلين المركزي

تصوير الجيل الثاني التوافقي للعينات البيولوجية هو تقنية بصرية تسمح بتصور الجزيئات غير المتماثلة وتجميعاتها دون الحاجة إلى علامة أو صبغة. الصور التي تم إنشاؤها باستخدام هذه الطريقة لها خلفية منخفضة لأن عددا قليلا جدا من الجزيئات البيولوجية يمكن أن تعمل كقوة متناغمة. يصف هذا البروتوكول تطبيق تقنية التصوير التشخيصي ل Tubulin beta-4A في نموذج taiep.

تم وصف اعتلالات الأنابيب مؤخرا بالأمراض. لهذا السبب ، تتوفر كمية محدودة من المعلومات حول الآليات الأساسية الكامنة وراء الفيزيولوجيا المرضية على المستوى الخلوي. للبدء ، قم بتشغيل الليزر النبضي للتأكد من أنه سيكون جاهزا للتشغيل بمستوى طاقة مثالي وثابت.

لدراسة الأنابيب الدقيقة tissular ، يتم استخدام 10 إلى 20 ٪ من طاقة الليزر المتاحة ، والتي في النظام الموصوف يتوافق مع 13 إلى 26 ملي واط تقاس في المستوى البؤري الخلفي للهدف. قبل التصوير ، أدر الليزر إلى 810 نانومتر. ثم تأكد من أن المجهر يتماشى مع كوهلر مع الهدف المستخدم للجيل التوافقي الثاني ، أو التصوير SHG.

قم بإزالة المرشحات غير المرغوب فيها من مسار الكشف البصري وتأكد من فتح غشاء المكثف بالكامل وعدم توقف أي ضوء دون داع. قم بإعداد هدف غمر زيت الفتحة العددية 25x × 0.8 مع قطرة صغيرة من زيت الغمر في العدسة. باتباع الخطوات المذكورة في الجدول هنا ، باستثناء طاقة الليزر التي تقل عن 5٪ لنشا الذرة.

صورة نشا الذرة الجافة محصورة بين الشرائح الزجاجية. مع معلمات SHG لإنشاء صور SHG ، فإنها تكشف عن اتجاه استقطاب الليزر. التقط صورة واحدة لحبيبات نشا الذرة المتناثرة وحدد اتجاه فصيصات SHG في المستوى XY المقابل لاتجاه استقطاب الليزر.

للتحكم ، التقط صورة أخرى لنفس العينة بإدخال لوحة نصف موجة في المسار البصري لتغيير اتجاه تذبذب الليزر. تعرض الصورة الناتجة فصيصات إشارة SHG التي تم تدويرها. إذا كنت تستخدم مرشح تمرير نطاق ترددي مختلف ل SHG ، فتأكد من أنه يتمتع بخصائص إرسال مثالية من خلال مقارنة الصور وشدة الإشارة بكسل تلو الآخر على طول خط المسح.

قم بإعداد صينية عازلة اهتزازية مملوءة بمحلول الملح المتوازن الدافئ من هانكس أو HBSS. ثبت الدماغ على لوحة العينة باستخدام غراء cyanoacrylate عبر قطعة من الشريط اللاصق. يتصل الجزء الأكثر ذيلية بالغراء بحيث يمكن قطع المقاطع الإكليلية القابلة للاستخدام من الجزء المنقاري المقابل.

انقل لوحة العينة إلى دعامتها المغناطيسية داخل الدرج العازل. ابدأ في قطع 300 إلى 500 ميكرون حتى تشمل الشرائح سطح الدماغ بالكامل. ثم قلل سمك القسم إلى 160 ميكرون.

بمجرد قطع قسم 160 ميكرون على مستوى الجسم الثفني ، قم باستعادته باستخدام ماصة باستور زجاجية معدلة مع فتحة كبيرة ذات حواف. انقل القسم إلى طبق بتري نظيف مع HBSS دافئ جديد أو مباشرة على زلة الغطاء أو الطبق السفلي الزجاجي للفحص المجهري. ضع العينة تحت المجهر وضعها بشكل مناسب تحت الهدف عن طريق الملاحظة المباشرة من خلال المنظار مع الضوء المرسل.

قم بإزالة HBSS الزائد بحيث يغطي فيلم سائل رقيق العينة بأكملها. تحقق بصريا من الفيلم السائل كل بضع دقائق لتجنب التبخر المفرط وتجفيف العينة. قم بإعداد مرحلة المجهر للتصوير غير الممسوح ضوئيا ، والذي يتضمن إغلاق جميع أبواب غرفة الحضانة المظلمة أو تغطية غرفة الحضانة بنسيج أسود مطلي بالنايلون البولي يوريثين.

حدد وضع التصوير غير الممسوح ضوئيا على طول مسار الإرسال. بهذه الطريقة ، سيتم تحسين التقاط إشارة SH الضعيفة للتوبولين. ثم حدد الهدف.

بعد ذلك ، اضبط طاقة الليزر بوقت سكون بكسل يبلغ 12.6 ميكروثانية. التقط صورا لا يزيد حجمها عن 512 × 512 بكسل بسرعة خمسة ومتوسط اثنين بمتوسط وقت اكتساب يبلغ 15 ثانية. التقط الصور أولا باستخدام مرشح تمرير قصير 485 نانومتر ، وفي الخطوة الثانية ، أضف مرشح تمرير نطاق حاد 405 نانومتر.

قطع المخيخ بمشرط إلى نصفي الكرة الأرضية وتثبيتها على دعم الاهتزاز من قبل الجزء الأوسط. قم بتقسيم المخيخ وتصويره باستخدام نفس إعدادات الاهتزاز والشفرة والمجهر كما هو موضح للدماغ. عندما يتم تصوير ألياف الجسم الثفني ، لوحظت هياكل قصيرة تشبه الألياف وعناصر مستديرة في دماغ تايب.

في المقابل ، يظهر الجسم الثفني للدماغ المتحكم إشارة أكثر تجانسا ومتباينة الخواص في جميع أنحاء منطقة الدماغ. يكمن أصل الإشارة التفاضلية على وجه التحديد في ظاهرة الجيل التوافقي الثاني لأن إضافة مرشح النطاق الترددي الضيق يقلل فقط من شدة الإشارة غير المحددة من صور التحكم ، مع إزالة هذه الإشارة المنتشرة المنخفضة بشكل انتقائي من حول الهياكل الطويلة الشبيهة بالسوما والقصيرة في صور taiep التي تولد دائما ضوء SH مكثف. في أنسجة التحكم في المادة البيضاء المخيخية ، لوحظ الغياب التام لإشارة SH.

بالكاد تكون خلايا Purkinje مرئية عند استخدام مرشح التمرير القصير ، وتستمر الهياكل الممدودة والمستديرة في صورة SH من نسيج taiep. الخطوة الحاسمة للحصول على أفضل صورة هي قطع أقسام الأنسجة رقيقة قدر الإمكان. علاوة على ذلك ، يتطلب العمل مع أقسام الأنسجة الحادة بروتوكولات سريعة لمنع تدهور الأنسجة.

لذلك ، من الضروري إعداد النظام البصري والتحقق منه مسبقا. الإشارة التوافقية الثانية من الأنابيب الدقيقة أضعف من الإشارة التوافقية الثانية من النشا. لذلك ، يجب استخدام المزيد من طاقة الليزر لتصوير الأنابيب الدقيقة.

يجب زيادة طاقة الليزر بعناية لأنه ، مع استخدام هدف فتحة عددية عالية للتصوير ، ستزداد الكثافة في العينة بسرعة مع التصوير التوافقي من الجيل الثاني ، يتم تحديد التغيرات المرضية في النخاع المركزي لنموذج توبولينوباثيك بسرعة وسهولة. تشمل التطبيقات المحتملة لهذه التقنية استخدامها لدراسة الآليات الأساسية لاعتلال الأنبوب H-ABC ولتقييم العلاجات الدوائية لعلاج المرضى. على المدى الطويل ، فإن هذه التقنية لديها القدرة على أن تصبح أداة تشخيصية تكميلية لاستخدامها داخل الجمجمة أو على خزعات جديدة.