تحليل تفاعل البروتينات ذات العلامات الفلورية مع الحويصلات الدقيقة الفوسفاتية الاصطناعية باستخدام قياس التدفق الخلوي الكمي

باستخدام طريقة قياس التدفق الخلوي للكمية هذه ، يمكن للباحثين حساب العادات الحركية والتوازن للتفاعل الغشائي الذي يتم إحضاره وتقدير عدد البروتين الذي تجلبه المواقع الموجودة على غشاء PPH. مزايا هذه الطريقة هي بساطة وتوافر الكواشف والمعدات. هذه الطريقة مخصصة حصريا للبحث الأساسي.

تم تطوير البروتوكول لدراسة تفاعلات الدهون البروتينية في حساب الدم ، ويمكن استخدامه في مجالات أخرى لتوصيف تفاعل البروتينات مع الأغشية الدهنية المختلفة. يمكن استخدام هذه الطريقة لتقييم كمية ديناميكيات ربط الليغاند على مختلف الخلايا وأنواع الليغاند. ابدأ تجارب الارتباط الحركي عن طريق تخفيف حويصلات الدهون الفوسفاتية في مخزن Tyrode العازل إلى تركيز ميكرومولير واحد وحجم إجمالي قدره 250 ميكرولتر.

ثم امزج عامل التخثر الفلورسنت المسمى X أو FX FD وتركيز 500 نانومولير مع حويصلات الدهون الفوسفاتية بنسبة واحد إلى واحد للحصول على حجم إجمالي قدره 500 ميكرولتر. حقن على الفور 500 ميكرولتر من التعليق المختلط في مقياس التدفق الخلوي. بمعدل تدفق بطول موجي للإثارة يبلغ 488 نانومتر ومرشح انبعاث يبلغ 585 نانومتر ؛ بعرض 42 للقناة FL الثانية.

بعد ذلك ، قم بقياس متوسط التألق في القناة FL Four مع الإثارة عند 633 نانومتر ومرشح الانبعاثات عند 660 نانومتر بعرض 20. عندما يتم تحقيق تشبع الارتباط ، قم بتخفيف العينة بسرعة 20 ضعفا باستخدام مخزن Tyrode المؤقت ، وراقب الانفصال حتى يتم الوصول إلى تألق أساسي ، أو هضبة. بالنسبة لتجارب ربط التوازن ، احتضن خمس حويصلات فوسفوليبيد اصطناعية ميكرومولية بتركيزات متفاوتة من FX FD من صفر إلى 1000 نانومولار في مخزن Tyrode المؤقت لمدة 20 دقيقة.

بعد الحضانة ، قم بتخفيف كل عينة بمقدار 20 ضعفا إلى حجم نهائي يبلغ 200 ميكرولتر باستخدام مخزن Tyrode المؤقت ثم قم بتحليل العينة المخففة عن طريق قياس التدفق الخلوي في غضون 30 ثانية. لتحليل البيانات ، قم بتصدير التجارب بتنسيق FSC من برنامج الحصول على بيانات القياس الخلوي إلى برنامج مقياس الخلايا لتحليل البيانات. عن طريق اختيار الملف ثم النقر فوق علامتي التبويب تصدير وملفات FSC.

بمجرد الانتهاء من فتح ملفات FCS في برنامج مقياس الخلايا عن طريق تحديد الملفات الموجودة على الكمبيوتر وسحب الملفات إلى مساحة عمل البرنامج. لبوابة الحويصلات الدقيقة ، حدد منطقة الحويصلات الدقيقة عن طريق التألق في الصبغة المحبة للدهون ، DIC 16 ثلاثة. ثم استخدم زر المؤامرة في ورقة العمل لإنشاء مخطط نقطي SSC من FL two D I C 16 في إحداثيات السجل.

ثم اختر زر البوابة المستطيلة لرسم منطقة بوابة. لتحليل التجارب الحركية ، قم بإنشاء مخطط نقطي باستخدام إحداثيات التألق بمرور الوقت لمنطقة الحويصلات. بعد ذلك ، قم بتصدير البيانات المتعلقة بالتغيير في التألق بمرور الوقت بتنسيق CSV ؛ من خلال اختيار العينة والنقر بزر الماوس الأيمن فوق علامة التبويب تصدير ، متبوعا باختيار FL أربع مرات في المعلمات ، حدد الدليل للحفظ قبل النقر فوق تحديد تنسيق CSV والضغط على علامة التبويب تصدير.

بعد النقل ، افتح ملف CSV في برنامج إحصائي لحساب تألق المتوسط المتحرك البسيط والوقت لكل 1000 حدث تقريبا رسم بياني لاعتماد تألق المتوسط المتحرك الواحد على الوقت تحت افتراض الاعتماد الأسي واستخدام القيمة لحساب ثابت الارتباط الحركي باستخدام معادلة. ثم احسب ثابت التفكك الحركي باستخدام المعادلة كما هو موضح سابقا. لتحليل تاريخ فحص ربط التوازن ، حدد متوسط تألق FX FD في منطقة الحويصلات لكل تركيز محدد من FX FD ثم قم بتقريب اعتماد تألق العامل المرتبط من تركيز العامل المضاف في افتراض ربط موقع واحد.

احسب متوسط معلمات الربط باستخدام معادلة من ثلاثة تكرارات مستقلة كحد أدنى. المضي قدما في إعداد الخرز معايرة عن طريق احتضان هلام الصفائح الدموية المصفاة مع الكالسيوم IANA 4A ثلاثة وعشرين ، مائة وسبعة وثمانين في وجود 2.5 ملليمولار كلوريد الكالسيوم لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة. هل تضيف الصفائح الدموية المنشطة تركيزات مختلفة من FX FD وتحتضن الصفائح الدموية بحجمين من الفورمالديهايد.

بعد ساعة واحدة ، أوقف التفاعل عن طريق احتضان الصفائح الدموية بثلاثة جليسين مولي و 5٪ BSA لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. ثم قم بتنقية الخليط من الصبغة غير المتفاعلة مع الطرد المركزي عند 400 مرة G لمدة خمس دقائق. قم بإزالة السوبرنات قبل إعادة تعليق الكريات في مخزن Tyrode العازل الذي يحتوي على 0.5٪ BSA.

بعد ذلك ، قم بقياس مستوى التألق لخرز المعايرة في كل عينة باستخدام مقياس الطيف الفلوري ثم باستخدام مقياس التدفق الخلوي. حدد عدد الخرز في كل عينة بمساعدة عداد الخلايا. قم بتحويل شدة التألق لكل عينة خرزة إلى تركيز صبغة الفلورسنت القابلة للذوبان باستخدام مقياس الطيف الفلوري وإعادة حساب تركيز صبغة الفلورسنت لعدد جزيئات مقياس الطيف الفلوري.

قم بإنشاء رسم بياني للاعتماد على متوسط تألق الخرز في مقياس التدفق الخلوي على عدد جزيئات الفلوروفور لكل عينة. ثم قم بتقريب الاعتماد حسب تناسب الخط باستخدام التحليل المناسب والمناسب لعلامات التبويب الخطية بالترتيب. من التقريب في المعادلة ، احسب عامل التحويل لمتوسط التألق إلى مواقع الربط.

في وقت لاحق حساب العدد الظاهري لمواقع الربط لكل حويصلة ذات أهمية. يظهر التحليل التمثيلي بوابة حويصلات الدهون الفوسفورية الاصطناعية التي يبلغ حجمها ميكرومتر واحد مع صبغة الفلورسنت المحبة للدهون المدمجة ، الصبغة I C 16 ، تم تعيين البوابة بناء على عينة تحتوي على نفس الحجم حويصلات الدهون الاصطناعية بدون صبغة الفلورسنت. تم تحليل حركية ارتباط البروتين بالحويصلات في المرحلة الأولى عن طريق جمع العينة بشكل مستمر.

تم تحليل البيانات التي تم الحصول عليها باستخدام قياس التدفق الخلوي. يجب أن تبدأ قياسات التدفق الخلوي في أقرب وقت ممكن بعد خلط المحاليل وتخفيفها مع مخزن Tyrode المؤقت. يمكن استكمال الطريقة المقترحة بالرنين البلازمي السطحي لدراسة التفاعلات الغشائية التي تكون حساسة للغاية مع دقة مؤقتة جيدة ولا تتطلب إحضارها في التسليم الميزة الرئيسية لهذه الطريقة هي إمكانية الوصول إليها وبساطتها.