قياس محتوى الحديد غير الهيم في الأنسجة باستخدام فحص كولوريمتري قائم على الباثوفينانثرولين

هنا قدمنا بروتوكولا لقياس محتويات غير الهيم في الأنسجة الحيوانية. باستخدام فحص لوني بسيط راسخ يمكن تنفيذه بسهولة في معظم المختبرات. لا يتطلب الفحص الكولوريمتري القائم على Bathophenanthroline مهارات متطورة أو معدات باهظة الثمن ويمكن تكييفه مع تنسيق microplate لزيادة إنتاجية العينة وفعالية التكلفة.

هذا البروتوكول مناسب للكشف عن التغيرات في مستويات الحديد في الأنسجة في مجموعة متنوعة من النماذج الحيوانية التجريبية للأحمال الزائدة للحديد أو كفاءة الحديد. ابدأ بقطع عينة من الأنسجة تزن من 10 إلى 100 جرام باستخدام شفرة مشرط. وزنها بدقة في ميزان تحليلي على قطعة صغيرة من البارافيلم.

استخدم ملاقط بلاستيكية لوضع قطعة الأنسجة في طبق من 24 بئرا. اتركه يجف على حاضنة قياسية عند 65 درجة مئوية لمدة 48 ساعة. بدلا من ذلك ، ضع قطعة الواد من الأنسجة باستخدام ملاقط العصا في كوب تفلون خال من الحديد وجففها في فرن الهضم بالميكروويف المختبري.

ضع كل قطعة مجففة من الأنسجة فوق قطعة صغيرة من البارافورم داخل ميزان تحليلي ووزنها بدقة. انقل كل قطعة مجففة من الأنسجة إلى أنبوب طرد مركزي صغير سعة 1.5 ملليلتر. أضف إضاءة من خليط الحمض إلى الأنبوب وأغلقه.

قم بإعداد حمض فارغ بنفس الطريقة باستثناء حذف الأنسجة هنا. احتضان الأنابيب عند 65 درجة مئوية لمدة 20 ساعة لهضم الأنسجة. بعد التبريد إلى درجة حرارة الغرفة ، استخدم ماصة صغيرة مزودة بأطراف بلاستيكية لنقل 500 ميكرولتر من مستخلص الحمض الشفاف إلى أنبوب طرد مركزي صغير جديد سعة 1.5 ملليلتر.

تحضير تفاعلات الكروموجين مباشرة في القاع المسطح 96 بئر ، وواضح غير معالج لوحات البوليسترين الصغيرة. درجة حرارة الغرفة المحتضنة لمدة 15 دقيقة. قياس امتصاص العينات في قارئ الصفائح بطول موجي يبلغ 535 نانومتر مقابل مرجع مائي منزوع الأيونات.

يتم عرض تحديد الحديد غير الهيم بواسطة الكوفيت و 96 بئرا على أساس الصفائح الدقيقة للقياس اللوني هنا. تظهر هنا العلاقة بين مستويات الحديد غير الهيم القائمة على الصفائح الدقيقة والقائمة على الصفائح الدقيقة في 55 عينة أنسجة من الذكور السود البالغ من العمر ستة أشهر ، وستة فئران ، بما في ذلك الكبد والطحال والقلب والرئتين ونخاع العظام. تشير العلاقة العالية بين المنهجيتين إلى أن الطريقة القائمة على اللوحة الدقيقة هي بديل صالح للطريقة الأصلية القائمة على الكوفيت.

وأخيرا، تم تحديد مستويات الحديد غير الهيم كميا باستخدام الطريقة القائمة على الصفائح الدقيقة بعد الهضم الحمضي للعينة المشتقة من نفس الأنسجة إما بمزيج من حمض الهيدروكلوريك وحمض ثلاثي كلورو أسيتيك أو حمض الهيدروكلوريك وحده. يظهر الارتباط العالي أن حمض ثلاثي كلورو أسيتيك يمكن أن ينبعث من هضم الحمض. تظهر الصورة التمثيلية مستويات الحديد غير الهيم في الكبد والطحال والقلب والبنكرياس للذكور السود ستة فئران من النوع البري وذكور الفئران الضربة القاضية من الهيبسيدين على خلفية وراثية سوداء ستة تم قياسها باستخدام الفحص الكولوريمتري القائم على باثوفينانثرولين.

يؤدي اضطراب الهيبسيدين إلى داء ترسب الأصبغة الدموية مثل النمط الظاهري لترسيب الحديد مع تراكم الحديد الكبدي والبنكرياس والقلب الشديد واستنفاد الحديد الطحالي. تظهر هنا مستويات الحديد الكبدي غير الهيم في قاروص البحر الأوروبي للإناث اليافعات بعد تعديل الحديد التجريبي. زادت مستويات الحديد الكبدي بشكل كبير في الحيوانات المعالجة بالحديد.

في حين تسبب فقر الدم في انخفاض طفيف في مخازن الحديد الكبدي. تظهر الصور التمثيلية مستويات الحديد غير الهيم في ذبابة الفاكهة البالغة من العمر شهرا واحدا والتي تم قياسها باستخدام فحص كولوريمتري قائم على باثوفينانثرولين. تظهر النتائج محتوى الحديد غير الهيم في كل تجمع من 20 ذبابة أو محتوى الحديد المقدر لكل ذبابة.

بالنظر إلى متوسط وزن 0.64 ملليغرام لكل ذبابة. أثناء محاولة هذا الإجراء ، تذكر تنظيف جميع تآكل الزجاج تماما وعدم السماح للمواد المختبرية المعدنية بالتلامس مع أي كاشف أو محلول بسبب خطر التلوث.