تقطيع جذع دماغ الدجاج السمعي الجنيني لتقييم التدرجات التونية والدوائر الدقيقة

تكتسب هذه الطريقة شرائح حية من جذع دماغ الدجاج السمعي الذي يشمل تدرجا أكبر من منطقة التردد في نفس الشريحة. هذه الشرائح مناسبة للتجارب الكهروفسيولوجية والتشريحية ذات المحور التونوتوبي الأكبر. ستساعد هذه المنهجية على فهم تطور الدوائر الدقيقة في جذع الدماغ السمعي.

في حين أن التشريح خاص بالدجاج ، فإن أنواع الطيور الأخرى مثل السمان والطيور المغردة لها تشريح مماثل. للبدء ، قم بتعقيم البيض بنسبة 70٪ من الإيثانول واحتضنه عند 38 درجة مئوية ورطوبة 50٪. بعد ذلك ، اضبط معدل الفقاعات ل ACSF بحيث يكون الرقم الهيدروجيني 7.2 إلى 7.4 مع أسمولية تتراوح بين 300 و 310 مللي أسمولير لكل لتر.

ثم امزج خمسة غرامات من الأغاروز في 100 ملليلتر من dACSF. يذوب الأغاروز تماما باستخدام حمام مائي أو ميكروويف حتى يبدأ الأغاروز في الفقاعات. يسكب الأغاروز المذاب في طبق بتري يصل سمكه إلى خمسة ملليمترات ويحفظ في درجة حرارة الغرفة لضبطه.

بعد الإعداد، أغلق طبق بتري وخزنه عند أربع درجات مئوية. قطع الأغاروز إلى كتل حجرة لاستخدامها في وقت التشريح. أولا ، قم بتنظيف منطقة التشريح باستخدام 70٪ من الإيثانول.

قم بلصق كتلة الأغاروز الداعمة أو الزاوية على صينية الاهتزاز. ضع البيضة تحت ضوء ساطع وحدد موقع المساحة المملوءة بالهواء على الجانب الأكبر أو المستدير من البيضة ، ثم قم بتكسير القشرة فوق المساحة المملوءة بالهواء وفضح كيس الغشاء. قم بعمل شق لطيف في الكيس لفضح المنقار.

باستخدام مشرط ، اسحب الرقبة بلطف وأخرج من البيضة. بعد قطع الرأس ، قم بتنظيف الرأس باستخدام dACSF المبرد. امسك الرأس ثابتا في dACSF المبرد وقم بعمل شق روستروذيالي.

ابدأ الشق خلف وبين العينين واتبع طول الرقبة المحصودة. افصل الجلد لفضح الجمجمة. قطع الجمجمة خلف العين في خط الوسط إلى الاتجاه الجانبي.

كرر ذلك لكلا نصفي الكرة الأرضية. قم بتقطيع الجزء العلوي من الجمجمة عن طريق وضع الشفرة خلف العينين وإجراء قطع سريع. ثم اغمر الرأس في طبق من dACSF المبرد.

باستخدام زوج من المقصات الصغيرة ، قم بعمل شقوق من خط الوسط إلى الشقوق الجانبية في المنطقة الذيلية من الجمجمة لفصل الدماغ دون التسبب في تلف الأنسجة. كشف بلطف جذع الدماغ والمخيخ. سحب المنطقة الظهرية من الجمجمة بأكملها.

قم بإزالة جذع الدماغ وتعريضه بالفرشاة الخفيفة باستخدام فرشاة طلاء ناعمة. استخدم ملقط منحني لتنظيف جذع الدماغ من ربط الأنسجة والأوعية الدموية. افصل جذع الدماغ عن المخيخ عن طريق قطع السيقان وإزالة الأوعية الدموية بعناية.

تقليم جذع الدماغ من الأوعية الدموية الإضافية. أولا ، ضع شفرة الاهتزاز على طول المحور الأفقي. بالنسبة للشرائح الإكليلية ، قم بلصق جذع الدماغ على صينية تقطيع من جانب السطح ، مع الحفاظ على المحور الوردي الذيلي عموديا.

بالنسبة للشرائح السهمية، حافظ على المحور الإنسي الجانبي عموديا. بالنسبة للشرائح الأفقية ، قم بلصق الجانب البطني مع الحفاظ على المحور البطني الظهري عموديا. لتحقيق المستوى الأفقي السهمي الزاوي الحاد ، قم بلصق الجانب البطني من جذع الدماغ بحيث يكون المحور الظهري البطني رأسيا على كتلة الأغاروز السطحية تحت الوتر.

قم بلصق السطح المقابل لكتلة الأغاروز التي تواجه صينية التقطيع وحافظ على المحور الوردي الذيلي موازيا لحافة الشفرة. كبديل لتقطيع الاهتزاز ، اغمر جذع الدماغ المعزول في أغاروز منخفض درجة الانصهار بنسبة 4٪ عند 40 درجة مئوية في طبق بتري 35 × 10 ملم. بعد أن يتصلب الأغاروز ، اقطع كتلة الأغاروز الحجرية باستخدام شفرة حلاقة حادة.

قم بلصق كتلة الأغاروز على جانبها العلوي مع الحفاظ على المحور الوردي الذيلي لجذع الدماغ عموديا. خذ شرائح إكليلية حتى يتم رؤية منطقة NM. قم بإزالة كتلة الأغاروز من الغراء بشفرة حادة.

باستخدام إبرة دقيقة ، ضع بلطف 0.5 ميكرولتر من صبغة تولويدين الزرقاء على NM لتحديد النوى. أعد تركيب هذه الكتلة على درج التقطيع بحثا عن شرائح سهمية أو أفقية. تحديد النوى فيما يتعلق بالمنطقة الملطخة وتقسيم جذع الدماغ.

بعد التقسيم ، ضع الشرائح التي تم جمعها بالتتابع من 200 إلى 300 ميكرون في غرفة شرائح تحتوي على ACSF لتحقيق التوازن لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة. تمثل الأقسام الإكليلية من أنسجة جذع الدماغ من جنين الدجاج E19 إلى 21 المناطق متساوية التردد النسبية لنوى جذع الدماغ السمعية من أدنى إلى أعلى منطقة سمعية ذات تردد مميز. كانت الألياف العصبية السمعية القريبة وتشعب محاور NM مرئية.

كما لوحظت النواة الزاوية. في أقسام السطح ، تقع النواة الزيتية العليا على طول المنطقة الجانبية البطنية للشريحة الإكليلية. في الأقسام السهمية ، تم تحديد NM و nucleus laminaris أو NL حيث دخلت الألياف العصبية السمعية إلى مجموعة الخلايا العصبية.

تم تحديد النواة الزيتية العليا في المنطقة الوردية الجانبية. شوهدت مناطق سمعية منخفضة وعالية التردد مميزة من NM و NL على طول المحور الوردي. أظهرت الشريحة الأكثر إنسية خصلات محورية جانبية ومتعارضة ونقطة نهاية المنطقة السمعية.

في الشرائح الأفقية ، تم تحديد NM و NL نحو خط الوسط ، وانتشرت الخلايا العصبية على طول المحور الإنسي الجانبي. أظهرت شرائح من أنسجة جذع الدماغ بزاوية حادة من مستوى أفقي نوى جذع الدماغ السمعية عبر انتشار قطري كبير. أظهرت الصور المكبرة المحور التونوتوبي للنوى السمعية على طول المحور الوردي إلى المحور الجانبي المذنب.

تأكد من أن العملية برمتها تتم في dACSF المبرد بالثلج باستمرار مع أكسجين الكربوهيدرات. يستخدم هذا البروتوكول للباحثين الذين يحققون في الخاصية التشريحية والفيزيائية الحيوية لتطوير الدوائر الدقيقة لجذع الدماغ ، وتحديدا العلاقة بين النوى السمعية الرئيسية.