نموذج لزراعة أعضاء القرنية البشرية لتجريد Descemet فقط مع الشفاء المتسارع الذي يحفزه عامل نمو الخلايا الليفية المصمم هندسيا 1

الغرض من هذا الفيديو هو وصف نموذج زراعة أعضاء القرنية البشرية من تجريد Descemet's فقط مع الشفاء المتسارع ، بتحفيز من عامل نمو الخلايا الليفية الهندسي الأول. ضمور القرنية البطاني لفوخ ، أو FECD ، هو مرض يتميز بفقدان وظيفة المضخة في الخلايا البطانية القرنية والتراكم المفرط للكولاجين وغيره من بروتينات المصفوفة خارج الخلية على سطح غشاء Descemet ، مما يشكل الأمعاء القرنية. العلاج الوحيد المعروف ل FECD هو رأب القرنية البطاني بأشكال مختلفة ، وكلها تأتي مع خطر الرفض وفقدان الخلايا البطانية.

في حين أن التقدم في جراحة العيون قد مكن هذه الإجراءات من أن تصبح أقل توغلا بمرور الوقت ، فإن أي شكل من أشكال الزرع يأتي مع خطر الرفض وإمكانية استخدام الستيرويد مدى الحياة. يعد تجريد Descemet's Stripping Only ، أو DSO ، بديلا تجريبيا حيث تتم إزالة مرضى FECD الذين يعانون من guttae الموضعي في وسط القرنية الدائرة المركزية التي تبلغ أربعة ملليمترات من غشاء Descemet دون استبدال الكسب غير المشروع. تشجع إزالة guttae الخلايا الطرفية السليمة على الهجرة إلى الداخل وإصلاح الطبقة الأحادية البطانية ، مما يؤدي في النهاية إلى عكس الوذمة اللحمية وتحسين الرؤية.

على الرغم من وجود العديد من المزايا لهذه الطريقة ، إلا أن عملية الشفاء طويلة وغير متسقة ، ويحتاج بعض المرضى إلى زرع الإنقاذ إذا لم يتم رؤية أي شفاء في الجراحة التالية للشهر. العلاج الذي يحفز التئام الجروح بشكل أسرع بعد واحة دبي للسيليكون ، قد يجعل الإجراء خيارا أكثر جدوى للمرضى الذين يعانون من FECD. يقوم هذا البروتوكول بنمذجة إجراء واحة دبي للسيليكون السريري في شكل زراعة الأعضاء باستخدام القرنيات البشرية المانحة ، بهدف اختبار العلاجات لتحسين التئام الجروح بعد واحة دبي للسيليكون ، لجعل واحة دبي للسيليكون خيارا أكثر جدوى للمرضى الذين يعانون من FECD.

يستخدم مختبرنا هذا النموذج لاختبار التئام الجروح في القرنيات المعالجة بعامل نمو الخلايا الليفية الهندسي الذي سنعرض له نتائج تمثيلية لاحقا في هذا الفيديو. في هذا الجزء من الإجراء ، سيتم استخدام لكمة خزعة لتحديد منطقة الجرح ذات الأربعة ملليمترات التي سيتم تجريد غشاء Descemet منها. باستخدام ملقط معقم ، قم بإزالة القرنية من الوسائط وشطفها في 1X PBS لإزالة الوسائط المتبقية وحطام الخلايا.

بعد الشطف ، ضع الجانب البطاني للقرنية لأعلى على غطاء طبق بتري. اغمس لكمة خزعة جديدة بأربعة ملليمترات باللون الأزرق المجرب في طبق لحام واضغط على الزائدة. باستخدام كلتا اليدين ، ضع اللكمة فوق مركز القرنية واخفضها مباشرة إلى السطح البطاني ، مع تطبيق الحد الأدنى من الضغط.

دون تغيير الوضع أو الضغط على القرنية ، قم بتحويل اللكمة إلى يد واحدة والوصول إلى الملقط باليد الحرة حديثا. استخدم الملقط لتثبيت القرنية في مكانها أثناء لف لكمة الخزعة بلطف حوالي 90 درجة ذهابا وإيابا عدة مرات. ارفع لكمة الخزعة مباشرة من القرنية واتركها جانبا.

شطف مرة أخرى في 1X PBS لإزالة الأزرق تريبان الزائد. انقل القرنية على غطاء طبق بتري إلى نطاق تشريح. تثبيت القرنية في مكانها باستخدام ملقط منحني يسجل غشاء ديسيميت عن طريق سحب طرف إبرة قياس 30 حادة برفق على طول حلقة التربان الزرقاء التي خلفتها لكمة الخزعة.

استخدم الحد الأدنى من الضغط لتجنب تعطيل السدى الأساسي. باستخدام خطاف sinskey ، استخدم حركات مغرفة لطيفة لرفع وتقشير غشاء Descemet حول حافة الجرح. العمل نحو مركز الآفة.

يجب أن يأتي غشاء Descemet بمقاومة قليلة جدا. إذا كنت تواجه صعوبة ، فمن المحتمل أنك تسحب السدى. إذا حدث هذا ، فابدأ من جديد ، وارفع من نقطة جديدة على طول حافة الجرح.

بمجرد فصل غالبية غشاء Descemet عن السدى ، استخدم ملقط Gorovoy لإزالة الغشاء ووضعه جانبا. افحص المنطقة المجردة بحثا عن أي قطع متبقية من الغشاء وقم بإزالتها باستخدام ملقط Gorovoy. بعد تجريد ديسيميت للقرنية باللون الأزرق التريبان لتصور منطقة الجرح.

شطف القرنية في 1X PBS التي تحتوي على 0.01٪ كلوريد الكالسيوم وكلوريد المغنيسيوم لإزالة حطام الخلايا التي يمكن أن تتفاعل مع التربان الأزرق وتسهيل الالتصاق الصارم من CECs المتبقية بغشاء Descemet سليمة. ضع القرنية في طبق ملحوم وماصة 30 ميكرولتر من التربان الأزرق على الطبقة البطانية لمدة 30 ثانية. استخدم الملقط لهز القرنية بلطف لضمان تغطية السطح البطاني بأكمله.

اشطف أزرق التريبان الزائد في PDS مع الكالسيوم والمغنيسيوم ، وصور القرنية الملطخة تحت مجهر تشريح لليوم صفر نقطة زمنية. بعد الانتهاء من هذا الإجراء ، قم بزراعة القرنيات في صفيحة بئر سداسية تحتوي على وسائط مصل منخفضة تتكون من المكونات المذكورة التالية. قم بزراعة القرنية اليسرى في ثمانية مطاحن من وسائط المصل المنخفضة وحدها ، والقرنية اليمنى في وسائط المصل المنخفضة المكملة ب FGF-1 المصمم هندسيا أو علاجات الاختبار الأخرى المطلوبة.

احتضان القرنيات عند 37 درجة مئوية مع 6٪ CO2 لمدة 14 يوما مع تغييرات الوسائط اليومية. كرر إجراء تلطيخ التربان في الأيام ، ثلاثة ، ستة ، تسعة ، 12 و 14 ، وصور كل قرنية مباشرة بعد التلطيخ. تأكد من الحفاظ على اتساق إعدادات الكاميرا عبر جميع النقاط الزمنية.

بعد فترة الزرع ، يمكن إجراء بقع إضافية على القرنيات بناء على الاهتمامات البحثية ، خاصة بالتجربة. تشمل البقع الإضافية ذات الصلة بالاهتمامات البحثية لمختبرنا تلطيخ Alizarin ، بالإضافة إلى تلطيخ الفلورسنت لدمج EDU وبروتينات الوصلة الضيقة ZO-1. يتم إجراء تلطيخ Alizarin لتصور حدود الخلية لتأكيد نتائج تلطيخ التربان وتصور مورفولوجيا الخلية في المنطقة الملتئمة.

يسمح تلطيخ الفلورسنت المناعي ZO-1 بتصور تكوين تقاطع ضيق بين CECs التي لها أهمية خاصة في المنطقة الملتئمة وحولها. يتم تنفيذ وضع العلامات على EdU كإجراء نوعي للتأكد من أن الانتشار يساهم في الشفاء ويمكن استخدامه أيضا لتحديد كمية الخلايا المتكاثرة في بعض السياقات. يتم تضمين تعليمات أكثر تفصيلا حول كيفية تنفيذ إجراءات التلطيخ المحددة هذه في المقالة المقابلة لهذا الفيديو.

فيما يلي صور تمثيلية لزوج من القرنيات التي تم الحكم عليها بأنها ضمور من قبل بنك العين والتي تم احتضانها مع أو بدون FGF-1 المصمم هندسيا على مدار 14 يوما. كما هو موضح في الصور ، أظهرت القرنية المعالجة ب FGF-1 هندسيا تسارعا في الشفاء مقارنة بقرنية التحكم غير المعالجة. تلطيخ Alizarin الإضافي في نهاية فترة الثقافة ، خدم في ترسيم حدود الخلايا وأكد مع هذه النتائج.

تم تكرار هذه الملاحظة عبر 11 زوجا من القرنيات الضمور للتحقق من صحة النموذج في عينة من القرنية الأكثر صلة بإجراء DSO السريري. يمكن استخدام برامج معالجة الصور ، مثل ImageJ ، لقياس المنطقة الملطخة في هذه الصور لتحديد تقدم التئام الجروح ، كما يمكن رؤيته هنا. أظهرت جميع القرنيات الضمور المعالجة ب FGF-1 هندسيا شفاء أكبر في اليوم 14 ، مقارنة بالمتة غير المعالجة مما أدى إلى شفاء 91٪ في المتوسط مقابل 38٪ في القرنيات الضابطة.

وكان هذا الاختلاف ذا دلالة إحصائية. كشفت الكيمياء النسيجية المناعية الإضافية التي تم تصورها بواسطة التصوير البؤري عن تعبير شبه منظم لبروتين الوصلة الضيق ZO-1 ، مما يعكس أنماط تلطيخ Alizarin السابقة. أكدت ملصقات EDU وجود خلايا تتكاثر في منطقة الجرح وحولها وكانت مرئية بمستويات أعلى في القرنيات المعالجة مقارنة بالضوابط غير المعالجة.

في بعض أزواج القرنيات، قد يكون موت CEC مرئيا محيطيا لمنطقة الجرح، خاصة في القرنيات الضمورية. فيما يلي أمثلة على صور القرنيات الملطخة بالتريبان التي تظهر موتا كبيرا للخلايا الطرفية. كما هو موضح في الصور ، يحدث موت الخلايا الطرفية في المقام الأول في نقاط زمنية سابقة وينعكس تدريجيا خلال فترة الثقافة.

يمكن أن يؤدي هذا التلطيخ المحيطي إلى تعقيد كمية منطقة الجرح عندما يتصل بالجرح حيث قد يكون من الصعب التأكد من موقع حافة منطقة الجرح. ومع ذلك ، في جميع الحالات ، تم مسح تلطيخ التربان المحيطي بما يكفي لإنتاج صور قابلة للقياس في اليوم الأخير 14 نقطة زمنية. نعتقد أن هذه الظاهرة فريدة من نوعها بالنسبة للقرنيات المانحة المستزرعة خارج الجسم الحي ، وليست ذات صلة بالقرنيات البشرية في الجسم الحي.

نظرا لعدم الإبلاغ عن الأضرار التي لحقت بالبطانة الطرفية في أي دراسات حالة سريرية لواحة دبي للسيليكون على حد علمنا. تم التقاط نمط تلطيخ ثان يشار إليه باسم التلطيخ المحيطي البعيد ، في صور Alizarin Red ، ولكنه كان واضحا أيضا في الصور الزرقاء التربان طوال فترة الثقافة. تتميز هذه الملاحظة بحلقة من التلطيخ الداكن حول الطرف تشير إلى بطانة معرضة للخطر.

على الرغم من المصطلح ، كان هذا النمط شائعا جدا في كل من القرنيات العادية والحثلية لدرجة أنه لم يتم احتسابها على أنها إيجابية للتلطيخ المحيطي. سمح لنا هذا البروتوكول بإظهار نتائج شفاء محسنة في القرنيات المستزرعة المعالجة ب FGF-1 المهندسة بعد تجريد Descemet. بالإضافة إلى ذلك، يعد بروتوكول التجريد هذا بمثابة طريقة قيمة للباحثين الآخرين الذين يدرسون واحة دبي للسيلمان، ويمكن استخدامه لمجموعة واسعة من التطبيقات بما في ذلك، اختبار علاجات التئام الجروح الأخرى، وتقييم التعديلات على التقنية الجراحية، ومقارنة الشفاء عبر مختلف الجهات المانحة أو مراحل المرض.

نأمل أن يشجع هذا البحث وغيره من الأبحاث التي تستخدم هذا البروتوكول الأطباء على اعتبار واحة دبي للسيليكون خيارا علاجيا قيما لمرضاهم المؤهلين للحصول على FECD في المستقبل.