فك رموز الآلية الجزيئية لتجميع هيستون بواسطة تقنية ستارة الحمض النووي

يوضح هذا البروتوكول كيفية استخدام تقنية ستارة الحمض النووي لدراسة ديناميكيات الكروماتين ، ولا سيما التحقيق في الوظيفة الجزيئية لمرافقي الهيستون. تقنية التصوير أحادية الجزيء عالية الإنتاجية ستارة الحمض النووي تتغلب على قيود التجارب السائبة وتسهل التصوير في الوقت الفعلي ، مما يتيح التوصيف التفصيلي لتفاعلات الجزيئات الحيوية. ضع ورقة نظيفة ذات أبعاد 5 × 35 ملم على وسط الشريط على الوجهين.

قم بتوصيل الشريط فوق الشريحة لتغطية الفتحتين وأنماط النانو بالورق. ثم قم باستئصال الورق باستخدام شفرة نظيفة. ضع زلة غطاء زجاجي أعلى الشريط على الوجهين ، وافرك زلة الغطاء باستخدام طرف ماصة لتشكيل غرفة الموائع الدقيقة.

ضع خلية التدفق المجمعة بين شريحتين مجهريتين ، وقم بقصهما. تخبز خلية التدفق في فرن مفرغ من الهواء بدرجة حرارة 120 درجة مئوية لمدة 45 دقيقة. قم بتوصيل موصل السائل للتحليل القائم على الشريحة بكل فتحة مفتوحة باستخدام مسدس الغراء الساخن.

وربط خطي أنابيب قفل إغراء. قم بتوصيل حقنة قفل إغراء تحتوي على ثلاثة ملليلتر من الماء منزوع الأيونات ، واغسل الغرفة. اغسل الحجرة مرة أخرى بثلاثة ملليلتر من المخزن المؤقت للدهون عبر اتصال قطرة بقطرة.

حقن ملليلتر واحد من 0.04x الدهون البيوتينيلة في العازلة للدهون ، في الغرفة ، في حقنتين ، مع حضانة لمدة خمس دقائق لكل حقنة. حقن 0.025 ملليغرام لكل ملليلتر من الستربتافيدين في ملليلتر واحد من BSA ، مع حقنتين ، وحضانة لمدة 10 دقائق لكل حقنة. حقن ما يقرب من 30 بيكومولار من الحمض النووي لعاثية لامدا البيوتينيلية في ملليلتر واحد من المخزن المؤقت BSA ، في الغرفة مع طلقتين ، وحضانة لمدة 10 دقائق لكل حقنة.

قم بتوصيل حقنة تحتوي على 10 ملليلتر من المخزن المؤقت للتصوير بمضخة حقنة ، وقم بإزالة الفقاعات في جميع خطوط الأنابيب في نظام الموائع الدقيقة. قم بإقران خلية التدفق المحضرة بنظام الموائع الدقيقة عبر اتصال قطرة إلى قطرة لتجنب حقن الفقاعة في خلية التدفق. قم بتجميع خلايا التدفق وحوامل خلايا التدفق ، وقم بتركيب التجميع على مجهر مضان انعكاس داخلي كلي مبني خصيصا.

قم بحقن 200 ميكرولتر من صبغة YOYO-1 في مخزن التصوير من خلال 100 ميكرولتر من حلقة العينة لتلطيخ جزيئات الحمض النووي لامدا. قم بتشغيل برنامج التصوير ، وقم بتشغيل الليزر 488 نانومتر للتحقق مما إذا كانت ستائر الحمض النووي جيدة التكوين. بعد إزالة صبغة YOYO-1 ، قم بحقن عينة البروتين المحتضنة مسبقا.

عندما تصل البروتينات إلى ستارة الحمض النووي ، قم بإيقاف تشغيل مضخة المحقنة ، وأغلق صمام الإغلاق ، واحتضانها لمدة 15 دقيقة لتحميل الهستون بواسطة Abo1. اغسل Abo1 غير المنضم وبروتينات الهستون لمدة خمس دقائق. قم بإيقاف تشغيل التدفق المؤقت بشكل عابر للتحقق مما إذا كانت بروتينات الهستون محملة على الحمض النووي.

تم فحص تشكيل ستارة الحمض النووي عن طريق تلطيخ جزيئات الحمض النووي بصبغة استيفاء. تشير الخطوط الخضراء الموضحة في المصفوفات المتوازية إلى أن YOYO1 المقحم في جزيئات الحمض النووي كانت محاذاة بشكل جيد وممتدة عند حاجز انتشار تحت التدفق الهيدروديناميكي. عندما تم حقن دايمرات Cy5-H3-H4 في ستارة الحمض النووي في غياب Abo1 ، لم يرتبط Cy5-H3-H4 بالحمض النووي ، مما يشير إلى عدم وجود ارتباط تلقائي لثنائيات H3-H4 بالحمض النووي.

عندما تم حقن Cy5-H3-H4 مع Abo1 ، شوهدت نقطية فلورية حمراء على جزيئات الحمض النووي ، مما يشير إلى أن Abo1 يحمل ثنائيات H3-H4 على الحمض النووي. اختفت إشارات الفلورسنت في غياب التدفق العازل ، وعادت إلى الظهور عند استئناف التدفق ، مما يشير إلى أن ثنائيات H3-H4 ترتبط بالحمض النووي. كما تم تأكيد ارتباط ثنائيات H3-H4 بالحمض النووي بواسطة kymograph ، حيث اختفت إشارات التألق كلما تم إيقاف التدفق.

ظهر عدد قليل من النقاط الفلورية في ستارة الحمض النووي ، إما في غياب النوكليوتيدات أو في وجود ADP ، مما يشير إلى أن ثنائيات H3-H4 نادرا ما ترتبط بالحمض النووي ، إما في حالة Apo أو في وجود ADP. يوضح التحليل الكمي أن عدد ثنائيات H3-H4 المرتبطة بالحمض النووي (DNA) تزداد في وجود الأدينوسين الثلاثي الفوسفات (ATP). تشير النتائج إلى أن التحلل المائي ATP ضروري لتحميل H3-H4 على الحمض النووي بواسطة Abo1.

يعد تجنب حقن الفقاعات في خلية التدفق هو الأكثر أهمية لجميع الخطوات. لذلك في هذا البروتوكول ، نؤكد على الاتصالات قطرة بقطرة. يمكن تمديد مقايسة ستارة الحمض النووي إلى ستائر الحمض النووي ذات الحبل المزدوج مع أنماط النانو المزدوجة.

بالإضافة إلى ذلك، يمكننا صنع نوع آخر من ستارات الحمض النووي (DNA) باستخدام خيوط أحادية الشريط من الحمض النووي (DNA) أو الحمض النووي الريبوزي (RNA) أو الأكتين. تتيح ستارة الحمض النووي تصور حركة البروتين على الحمض النووي وتسهل دراسة آلية البحث عن الهدف. يمكن تمديد ستارة الحمض النووي لدراسة استقلاب الحمض النووي بما في ذلك النسخ المتماثل والنسخ.